蛋白酶及其抑制剂关键活性位点研究进展

蛋白酶和蛋白酶抑制剂被广泛应用于农业、工业以及医疗行业。蛋白酶在以水稻为原料生产燃料乙醇和微生物发酵降解豆粕抗营养因子过程中发挥重要作用。植物中蛋白酶抑制剂可以抑制昆虫肠道水解酶，从而保护植物不受农林害虫的侵害。植物源胰蛋白酶抑制剂的失活可提高动物对植物蛋白的利用率，过表达这些蛋白酶抑制剂则有助于培育转基因抗虫作物[1]。众所周知，蛋白酶和蛋白酶抑制剂活性异常与人类癌症、病毒感染、凝血等众多疾病有关，可作为研发特异性药物的重要靶点[2]。因此，有必要研究蛋白酶及蛋白酶抑制剂的活性作用机制，改善和调节蛋白酶及蛋白酶抑制剂的生物活性。通过对自然界蛋白酶和蛋白酶抑制剂的各种突变体进行挖掘，探究它们的关键活性位点，并运用蛋白质工程手段改造和设计活性更强、稳定性更高、特异性更好、环境更友好、成本更低的蛋白酶和蛋白酶抑制剂，已成为酶和抑制剂领域的研究热点之一。本文从关键活性位点突变对生物学效应的影响、关键活性位点分析、生物工程改造及其应用等方面，对蛋白酶及蛋白酶抑制剂关键活性位点研究进行综述，以期深化人们对蛋白酶及其抑制剂活性作用机制的认识，并为蛋白酶及蛋白酶抑制剂的生物学活性改造研究提供理论参考。

蛋白酶广泛分布于动物、植物和微生物中，其主要作用是催化蛋白质和多肽水解。蛋白酶对生物体起着重要作用，其活性受到严格的调节和控制，蛋白酶过量表达也会损害机体健康。蛋白酶抑制剂是一类可以适时与靶蛋白酶活性部位或变构部位结合，使蛋白酶活力下降或消失的物质。蛋白酶和蛋白酶抑制剂共同参与调节机体的许多生理反应。生物界中存在丰富的蛋白酶，同时也存在种类繁多的蛋白酶抑制剂。根据催化中心不同，可将蛋白酶分为丝氨酸蛋白酶、半胱氨酸蛋白酶、天冬氨酸蛋白酶和金属蛋白酶。根据氨基酸序列的同源性和靶向蛋白酶的不同，蛋白酶抑制剂又可分为丝氨酸蛋白酶抑制剂、半胱氨酸蛋白酶抑制剂、天冬氨酸蛋白酶抑制剂以及金属蛋白酶抑制剂[3]。

蛋白酶属于大分子生物催化剂，催化反应具有高效性和专一性。它的活性中心包括催化部位和结合部位，催化部位决定酶的催化功能，结合部位负责结合底物，决定酶的特异性。因此，催化中心和底物结合位点的一些氨基酸残基影响着酶活性和底物特异性。蛋白酶使催化中心的蛋白底物肽键水解，生成短肽或游离氨基酸。蛋白酶与底物结合的氨基酸侧链基团的性质、大小和结构均能对蛋白酶底物特异性产生重要影响[4]。研究蛋白酶催化中心和底物结合部位的氨基酸有助于改善其催化效率和底物特异性。

蛋白酶抑制剂能够有效抑制靶蛋白酶，其主要原因是蛋白酶抑制剂暴露的反应中心与蛋白酶活性中心结合，形成“抑制剂-酶复合物”，并且蛋白酶抑制剂与靶酶的结合亲和力远远大于底物与酶的结合亲和力。因此，蛋白酶抑制剂优先与靶酶结合，导致靶酶活性中心肽链无法裂解，使得靶酶不能再与其他蛋白酶底物结合，从而失去酶活性。蛋白酶抑制剂通常含有一个或多个结构域，结构域中的一些氨基酸残基为蛋白酶提供接触位点，形成反应中心[5]。蛋白酶抑制剂反应中心的氨基酸通常决定了其抑制活性和抑制特异性。此外，很多蛋白酶抑制剂富含半胱氨酸(Cysteine，Cys) 残基，形成多对分子内二硫键桥，这些二硫键维持着蛋白刚性结构的稳定，对蛋白酶抑制剂的生物学活性至关重要。这些关键活性位点的改变皆可能影响蛋白酶抑制剂的活性或特异性。因此，合理设计、改变关键活性位点的氨基酸性质有利于改进蛋白酶抑制剂的抑制活性和抑制特异性。

人胰凝乳蛋白酶C的氨基酸突变是慢性胰腺炎诱因之一。哺乳动物中慢性胰腺炎(Chronic pancreatitis，CP) 是以胰腺破坏、消化不良和慢性疼痛为特征的一类疾病。人胰凝乳蛋白酶(Chymotrypsin C，CTRC) 是由胰腺合成分泌的一种消化性丝氨酸蛋白酶，其主要作用是调节胰蛋白酶激活和水解的平衡，保护胰腺组织结构免受胰蛋白酶过度活化的破坏[6-7]。热带钙化性胰腺炎中的CTRC基因分析表明，CTRC基因在慢性胰腺炎发病过程中起重要作用，CTRC基因突变会增加慢性胰腺炎的发生机率[8-10]。对CTRC的8个天然变异体的研究显示，其中5个具有正常酶活性，R29Q失去催化活性，S239C的催化活性降低；值得注意的是，G214R对多肽显色底物的水解活性增强，但对牛酪蛋白或其他天然底物(人胰蛋白酶原和羧肽酶A1) 的水解活性显著降低[11]。上述研究表明，CTRC氨基酸突变体R29Q、S239C、G214R引起的生理功能紊乱可能是慢性胰腺炎的重要危险因素之一。

组织蛋白酶D中的D231残基对其催化活性至关重要。组织蛋白酶D (Cath-D) 是一种由乳腺癌细胞高度分泌的天冬氨酸蛋白酶，参与多种生理过程，在血管生成、肿瘤发生、转移、侵袭，以及细胞凋亡和增殖等方面都具有重要作用[12]。Cath-D的催化位点D231N突变可使其水解活性降低，但不影响其表达、加工和分泌。Cath-D的D231N突变体转染到3Y1-Ad12大鼠肿瘤细胞后仍能促进细胞生长，提示Cath-D的有丝分裂活性与其催化活性无关[13]。

HIV-1蛋白酶是一种天冬氨酸蛋白酶，在病毒复制中起重要作用。研究发现，HIV-1蛋白酶突变与耐药性相关，对HIV-1蛋白酶突变相关的耐药性检测有助于改善艾滋病患者的病毒学结果[14]。成熟HIV-1蛋白酶的活性位点区的Asp25和Asp29突变会影响其与蛋白酶抑制剂的结合。大多数临床应用的HIV-1蛋白酶抑制剂对D25N和D29N的突变体蛋白具有高度敏感性，与Asp25突变相比，Asp29突变对达鲁那韦(Darunavir)、阿扎那韦(Atazanavir)、沙奎那韦(Saquinavir)、利托那韦(Ritonavir)、安普那韦(Amprenavir) 等5种临床抑制剂的结合影响较小[15]。另有研究显示，HIV-1蛋白酶的L76V突变可能与罗匹那韦(Lopinavir)、安普那韦和达鲁那韦的临床应用的带来的长期选择效应有关。L76V突变虽然增加了HIV对上述药物的耐药性，但也同时赋予了其对阿扎那韦和沙奎那韦药物的敏感性，长期接受阿扎那韦或沙奎那韦和一种L76V选择药物联合用药的患者治愈率显著高于不使用L76V选择药物治疗的患者[16]。

细胞外基质金属蛋白酶MT1-MMP突变影响骨组织发育。遗传性溶骨综合征是一种罕见的骨骼疾病，其特征是骨溶解和关节破坏。研究发现，缺失胶原酶会导致骨溶解和关节破坏，因此细胞外基质蛋白水解与骨骼生长发育密切相关[17]。MT1-MMP是一种膜结合基质金属蛋白酶，能够介导细胞外基质成分细胞周蛋白水解。MT1-MMP缺陷小鼠全身骨质减少，生存率严重下降，说明MT1-MMP对骨骼硬组织发育和维持十分重要。已有研究证实，氨基酸突变引起的基质金属蛋白酶2 (MMP2) 活性丧失与遗传性溶骨综合征有关，R101H和Y244X替换导致该酶的底物结合位点和催化位点缺失[18]。遗传性溶骨征患者的成纤维细胞中含有丰富的MMP-2酶原，MMP-2活性很低[19]。MT1-MMP是MMP-2上游重要的激活剂，其需要定位到细胞膜上发挥功能。MT1-MMP在信号肽疏水区的突变(T17R) 降低了MT1-MMP的膜定位，从而损害了MMP2酶原的活化[19]。另有研究显示，N-乙基-N-亚硝基脲(N-ethyl-N- nitrosourea，ENU) 诱变后产生了一个表型不正常的系，称为“卡通小鼠”，它在生长和发育方面表现出严重的缺陷；“卡通小鼠”MT1-MMP的血红素结构域中存在单位点突变S466P，该血红素结构域对MT1-MMP胶原溶解活性具有重要调节作用；S466P替换不会导致MT1-MMP蛋白水解活性丧失，但会赋予血红素结构域新的特性，使其保留在内质网中，不能运输到细胞表面，从而导致功能表型丧失[20]。

除此之外，芽孢蛋白SpoIVFB保守基序突变阻断转录因子σK活性。枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis的产孢蛋白SpoIVFB是金属蛋白酶家族成员，其催化中心邻近或在膜内。SpoIVFB含有金属蛋白酶共有的保守序列“HEXXH”和该家族特有的第二个保守序列“NPDG”，这两个序列是蛋白酶的催化中心[21]。SpoIVFB可以将膜相关前体蛋白pro-σK氨基端的20个氨基酸残基切除，使其转换为成熟的活性转录因子σK[22-23]。在革兰氏阳性枯草芽孢杆菌芽孢形成过程中，σK在调控基因表达中起着核心作用。研究表明，HEXXH基序和NPDG基序中的氨基酸替换皆会损害产孢过程中pro-σK的加工和σK相关基因的表达[21]。

研究发现，家蚕丝氨酸蛋白酶BmSP36、BmSP141和BmSP95的关键活性位点影响底物特异性。家蚕Bombyx mori是一种重要的鳞翅目经济昆虫。笔者所在研究团队系统鉴定了家蚕基因组中的丝氨酸蛋白酶基因，共鉴定到51个丝氨酸蛋白酶(SP) 基因和92个丝氨酸蛋白酶同系物(SPH) 基因。活性位点分析表明，51个SP的活性部位具有一个典型的催化三联体结构Ser-His-Asp，其余92个SPH的活性部位不具有完整的催化三联体结构，因此它们可能失去了催化功能[24]。笔者所在研究团队对家蚕丝氨酸蛋白酶BmSP36、BmSP141、BmSP95的功能和活性位点进行了深入研究。BmSP36属于胰凝乳蛋白酶样丝氨酸蛋白酶，该酶在中肠上皮中表达并能分泌到中肠腔，在家蚕发育过程中参与蛋白质的消化。BmSP36具有完整的催化三联体结构His57-Asp102-Ser195和保守的底物特异性结合位点Gly189、His216和Gly226[25]。BmSP141在中肠特异性表达，参与食物消化过程。多序列比对显示，BmSP141也具有完整的催化三联体结构His57-Asp102-Ser195，其底物特异性结合位点为Gly189、Val216和Ser226，其中Gly189较为保守，Val216和Ser226发生突变可能会改变其底物特异性[26]。BmSP95是一个典型的Clip结构域丝氨酸蛋白酶，它由一个羧基端的胰蛋白酶样的SP结构域(Tryp_spc) 和一个氨基端Clip结构域组成[27]。Clip结构域通常由37–55个残基组成，该结构域中6个保守的半胱氨酸残基形成3个二硫键，在昆虫发育和免疫反应中具有重要的作用[28]。丝氨酸蛋白酶BmSP95在蜕皮和变态过程中表达，表皮细胞中合成的BmSP95蛋白以酶原的形式分泌，并在蜕皮液中被激活，参与蜕皮和变态过程中的表皮重塑[27, 29]。BmSP95不仅具有完整的催化三联体结构His57-Asp102-Ser195，还具有3个保守的底物结合位点Asp189、Gly216和Gly226，该底物结合位点可能决定了蛋白酶底物特异性[27, 30-31]。

另有研究发现，布鲁氏锥虫的寡肽酶B (Oligopeptidase B，OPB) 关键活性位点突变会影响其与催化活性和热稳定性。寡肽酶B属于丝氨酸蛋白酶中脯氨酰寡肽酶(Prolyl oligoptidase，POP) 家族成员，在革兰氏阴性菌、植物及锥虫中皆有发现[32]。已有研究表明，OPB蛋白是布鲁氏锥虫Trypanosoma brucei的重要毒力因子，可作为非洲昏睡病的重要治疗靶点[32]，该酶催化结构域中Glu607、Glu609和Glu610在OPB亚家族中高度保守，Glu607、Glu609是与底物P1残基结合的关键残基[33]。采用定点诱变方法，将Glu607、Glu609和Glu610分别替换为Gln，研究这3个位点Glu残基在Tb OPB中的作用[34]。结果显示，E607Q会显著影响Tb OPB的Kcat/Km值，表明Glu607对Tb OPB的催化活性至关重要。相比之下，E610Q对催化性能的影响明显小于E607Q，但其E610Q突变体在热处理后更容易失活，提示Glu610在维持酶的热稳定中发挥关键作用。

此外，沙门氏气单胞菌丝氨酸蛋白酶ASP的关键活性位点突变可影响其底物选择和蛋白酶水解活性。嗜水气单胞菌Aeromonas hydrophila是一种革兰氏阴性菌，主要存在于水生环境中与人类疾病密切相关。嗜水气单胞菌的毒力菌株可产生多种细胞外毒素和蛋白酶，这些蛋白酶的表达和分泌会增加菌株毒力[35]。沙门氏气单胞菌Aeromonas sobria可分泌一种丝氨酸蛋白酶ASP，该蛋白酶可以水解宿主细胞防御系统中的关键蛋白质，参与肠道疾病的发生过程[36-37]。研究表明，ASP的Arg566残基具有识别底物P3位点的能力，是决定ASP底物选择的关键位点。将蛋白酶ASP中Arg566替换为Ala (R566A)，可使ASP失去对底物识别的能力，从而大大降低其对底物蛋白水解效率[38]。

基孔肯雅病毒半胱氨酸蛋白酶NSP2pro、脊髓灰质炎病毒内肽酶3C和化脓性链球菌SPE B均在病原微生物感染过程中具有重要作用，它们的活性位点影响蛋白酶水解效率和底物结合。基孔肯雅病毒(Chikungunya virus，CHIKV) 是一种主要由蚊子传播的节肢动物传染性甲型病毒，感染后引起发热、黄斑皮疹、关节痛、头痛寒冷等症状[39]。该病毒编码的半胱氨酸蛋白酶NSP2pro是一种调节宿主细胞，控制免疫反应的多功能蛋白，可作为一种潜在的抗病毒药物靶点[40-41]。NSP2pro晶体结构显示该蛋白由一个N端蛋白酶亚结构域和一个C端甲基转移酶亚结构域组成，底物结合裂隙存在于两个亚结构域的界面[42-43]。NSP2pro的两个亚结构域间的柔性环可阻断底物靠近其催化位点和底物结合位点，该环包含催化位点His548和预测的底物结合位点Trp549和Asn547。将Asn547替换为Ala后导致酶Km增加3倍，表明Asn547在底物结合和识别中发挥重要作用[44]。

脊髓灰质炎是一种人类病毒性疾病，由脊髓灰质炎病毒(Poliovirus，PV) 引起。PV基因组编码一个247 kDa的多蛋白PV 3ABC，该多蛋白能被内肽酶3C等病毒蛋白酶切割成几种单独或融合蛋白质。脊髓灰质炎病毒3C是具有胰凝乳蛋白酶样活性的半胱氨酸蛋白酶，其分子量为20 kDa，由两个反平行的6链β-桶结构域组成。活性位点裂隙位于两个结构域交界处，由催化三联体His40-Glu71-Cys147和亲电氧阴离子洞(Gly145、Gln146、Cys147) 组成[45]。活性位点裂隙附近的其他残基可能与稳定活性位点结构以及底物相互作用有关。在大肠杆菌中表达PV 3ABC蛋白的过程中，发现一个3C突变体(L70P)，该突变体的蛋白酶活性丧失。结构分析表明，Leu70靠近3C催化位点，L70P突变导致Leu62和Leu70之间无法形成氢键，引起构象变化，从而影响催化位点上的底物结合[46]。

几乎所有对人类有致病性的化脓性链球菌都表达高度保守的胞外半胱氨酸蛋白酶，称为链球菌发热性外毒素B (Streptococcal pyrogenic exotoxin B，SPE B)。许多独立研究表明，这种酶参与宿主-寄生虫相互作用的一个或多个阶段，如炎症、软组织入侵以及抑制巨噬细胞清除凋亡细胞[47]。该蛋白酶以40 kDa的无活性酶原形式存在，通过自催化作用断裂生成28 kDa的活性蛋白酶[48-49]。研究发现，Cys192参与活性位点形成和酶的催化。C192S突变后，突变体蛋白不能通过酶原自催化生成成熟体形式，致使其对牛酪蛋白、人纤连蛋白和小分子合成底物的水解活性丧失[50]。

研究发现，关键活性位点突变导致天冬氨酸蛋白酶NapsinA的活性丧失，白色念珠菌毒力蛋白酶Sap7对天冬氨酸蛋白酶抑制剂Pepstatin A的敏感性增强。与癌症有关的天冬氨酸蛋白酶NapsinA在肺Ⅱ型细胞中表达，参与表面活性蛋白B (SP-B) 的加工[51]。NapsinA催化中心Asp残基突变(D283N) 可使酶失活，但不影响其抑制肿瘤形成的能力，也不影响NapsinA的加工、糖基化和细胞内定位[52]。此外，白色念珠菌Candida albicans是常见的真菌病原体，广泛存在于人类机体中，可使宿主罹患念珠菌病。白色念珠菌产生的3种最重要的胞外水解酶分别是分泌型天冬氨酸蛋白酶、磷脂酶B酶和脂肪酶。SAP基因家族编码的10个分泌型天冬氨酸蛋白酶(Secreted aspartic proteases，Saps) Sap1–Sap10都是重要的毒力因子，其蛋白质大小在35–50 kDa之间[53-54]。从白色念珠菌SC5314中克隆出SAP7基因，并在毕赤酵母中表达出Sap7蛋白。鉴于Sap7对天冬氨酸蛋白酶抑制剂Pepstatin A不敏感，研究者在Sap7活性位点入口附近构建了M242A、T467A两个突变体。结果显示，M242A和T467A突变体不仅具有正常的蛋白水解活性，还获得了对Pepstatin A的敏感性，该发现将有助于开发新型蛋白酶抑制剂[55]。

工业上，天冬氨酸蛋白酶广泛应用于食品、动物饲料、发酵、制药和皮革等领域[56-57]。牛凝乳酶是一种天冬氨酸蛋白酶，可以选择性地裂解牛奶中的κ-酪蛋白，从而开始凝固以帮助消化。研究发现，骆驼Camelus ferus凝乳酶是牛奶的有效凝结剂，骆驼凝乳酶对牛奶的凝结活性比牛胰凝乳酶高70%，而非特异性蛋白酶水解活性仅为牛凝乳酶的20%，但牛凝乳酶不能使骆驼奶凝固[58]，因此，有必要改进牛凝乳酶和骆驼凝乳酶的催化活性。已有研究证实，牛凝乳酶表面水结合位点有助于稳定凝乳酶-κ-酪蛋白复合物，可以使用分子积分方程理论精确计算牛凝乳酶-κ-酪蛋白复合物中单点突变体的相对结合热力学[59]。在牛和骆驼凝乳酶结合位点处的12个单位点突变体中，D112E、K221V、Q242R、Q278K、E290D、H292N、Q294E和K295L等8个突变体对理解结合热力学的差异极为重要。牛凝乳酶中的Q242R和Q278K突变体更有利于κ-酪蛋白结合，而骆驼凝乳酶中D112E、K221V和K295L突变体更有利于κ-酪蛋白结合[60]。

基质金属蛋白酶MMPs结构域Ⅱ/Ⅲ突变导致酶失活。基质金属蛋白酶(Matrix metalloproteinase，MMPs) 是结构中含Zn2+和Ca2+的蛋白水解酶类，主要参与细胞外基质的代谢，在血管生成、胚胎发生、形态发生、伤口修复等多种生理过程，以及心肌梗塞、纤维化疾病、骨关节炎、癌症、组织重塑等多种病理过程[61]。MMPs在蛋白质中存在3个结构域：结构域Ⅰ包括信号序列和前肽[62]；结构域Ⅱ包含活性位点和催化锌结合区[63]；结构域Ⅲ具有与血红蛋白同源的羧基末端，可能作为天然抑制剂(如TIMP) 结合位点的一部分发挥作用[63-64]。有研究指出，结构域Ⅲ使结构域Ⅱ中的活性位点具有底物特异性[62]。在蛋白质浓度较高的情况下，结构域Ⅱ/Ⅲ交界处的自水解效应会阻碍全长活性胶原酶(即Ⅱ+Ⅲ结构域) 的结晶过程[65]。因此，可通过改变该区域可能的靶肽键，生成一种无活性的胶原酶。将His149替换为Leu、Asp151替换为Asn，获得胶原酶的双突变体H149L/D151N，进而耗尽非催化性锌原子，无法裂解合成的底物。此外，与野生型胶原酶相比，单位点突变体I251S对蛋白水解的抗性增强[65]。

另有研究显示，金属肽酶(Metzincins) 中蛋白酶C的Met替换与蛋白水解活性相关。Metzincins主要作用是参与非特异性蛋白质降解，如摄取蛋白质的消化和组织发育、维持和重塑等[66]。Metzincins超家族包括基质金属蛋白酶(MMP)、去整合素和金属蛋白酶(ADAM) 以及具有血小板反应素基序(ADAMTS) 的ADAM[67]。Metzincins是一类多结构域蛋白，具有大约130–260个残基的球状催化结构域。该催化结构域存在共同的核心结构，即一个长的锌结合共有基序HEXXHXXGXX (H/D) 和一个含有甲硫氨酸的转角(Met-turn)，其中3种His是锌配体，Glu是催化位点。位于这个共有基序下游的Met是完全保守的，该Met对蛋白酶水解活性或结构完整性很重要[66, 68]。菊欧氏杆菌Erwinia chrysanthemi蛋白酶C是Metzincins家族中Serralysin亚家族的一员，其共有基序下游保守的Met226被Ile，Ala和His所取代后，蛋白酶的水解活性显著降低。此外，将其催化位点Glu189替换为Ala后，突变体蛋白E189A完全失活，该突变体蛋白易于提纯和结晶[69]。晶体结构解析显示，Met的替换可使锌结合基序的几何结构扭曲，进而导致多肽链大片段的柔性增加，蛋白水解活性丧失[69]。

金属酶都含有1–2锌离子。在许多单锌酶中，皆有一个能形成α-螺旋的HExxH基序，该基序是与Zn2+配位的活性位点。大鼠二肽基肽酶(DPP Ⅲ) 也是一种单锌酶，该酶具有一个独特的锌结合基序“HELLGH. . . . E” (残基450–455, 508)，该基序为与Zn2+配位的活性位点[70]。定点诱变实验表明，锌结合基序对酶活性非常重要，His450、His455和Glu508参与了锌配位，并且Glu451也参与了催化活性[70]。删除apo-DPP Ⅲ锌结合基序中的Leu453获得apo-Leu453-del-DPP Ⅲ，该酶的活性丧失，可见和电子顺磁共振谱显示，Cu2+可与其基序部分“HELGH”结合[71]。

纳豆激酶(Nattokinase，NK) 最早从日本传统食物“纳豆”中鉴定出来，是枯草杆菌蛋白酶家族的丝氨酸蛋白酶。NK是一种高效的纤溶酶，不仅可以用于治疗血栓还可以预防疾病，如抗高血压、抗动脉粥样硬化、降血脂和神经保护作用等[72-73]。NK作为一种治疗心血管疾病的口服药物，它必须克服胃肠道的酸性环境。因此，为提高NK的耐酸性，Liu等采用定点诱变技术构建了11个突变体，从中筛选出4个具有独特的催化性能的单位点突变体[74]。结果表明，Q59E增加了比活性，S78T提高了酸稳定性，Y217K增强了酸稳定性和热稳定性，N218D改善了热稳定性[74]。继续构建多位点突变体，得到了具有较好的酸稳定性、催化效率和热稳定性的突变体。突变体SY (S78T/Y271K) 在低pH下具有最佳的耐酸性能和较高的活性，QN (Q59E/N218D) 和QSN (Q59E/S78T/N218D) 具有最佳的热稳定性，而QYN (Q59E/Y271K/N218D) 具有较好的耐酸性、催化效率和热稳定性[74]。

半胱氨酸蛋白酶Casp6活性位点突变与阿尔茨海默病及年龄依赖性认知障碍相关，该酶中的3个Arg突变会显著降低其底物亲和力。半胱氨酸蛋白酶Caspase-6 (Casp6) 是参与调节细胞死亡、控制炎症反应和免疫反应的Caspase家族的成员，对宿主防御起着重要作用[75-76]。Casp6是阿尔茨海默病(Alzheimer disease，AD) 和年龄依赖性认知障碍的潜在治疗靶点[77-78]。对Casp6中两个罕见的氨基酸突变体R65W和G66R研究发现，Casp6-G66R和Casp6-R65W会降低其与底物的结合能力，从而使Casp6的催化活性大大降低。另外，与野生型Casp6相比，这两种Casp6突变体在转染的哺乳动物细胞中均不稳定且无活性[79]。除底物结合位点之外，Caspase结构中还存在其他影响其底物特异性的位点。外结合位点是远离蛋白质底物结合沟，且能影响蛋白质结构或功能的位点。外结合位点在Caspase招募、接合、定向底物中发挥重要作用[80]。Casp6N端结构域NTD (残基23–45) 内的三精氨酸基序(42RRR44) 可作为外结合位点发挥作用，参与Casp6对蛋白底物的招募过程。当42RRR44受损，会大大减弱Casp6的底物亲和力。通过位点诱变技术，取代Casp6中的Arg42、Arg43、Arg44均能显著改变蛋白质底物水解速率[81]。

研究表明，破坏组织蛋白酶B中的闭塞环结构可提高其与胱抑素的亲和力。半胱氨酸蛋白酶中的组织蛋白酶B (Cath-B) 是木瓜蛋白酶超家族成员之一，既可作为内肽酶又可以作为肽基二肽酶。Cath-B在癌症发生过程中有重要作用，如控制肿瘤生长、迁移、侵袭，血管生成和转移瘤发展等[82-83]。晶体结构解析发现，与木瓜蛋白酶超家族其他成员相比，Cath-B含有一种独特的“闭塞环”结构，将位于界面区“顶部”的活性位点裂隙封闭在该环的后方，阻碍了胱抑素与Cath-B活性位点的结合，这似乎有利于具有两个羧基末端的肽底物结合到易裂解的肽键上。闭塞环中的His110和His111可以为多肽底物的羧基端羧基基团提供带正电荷的锚点。这些结构特征解释了组织蛋白酶B的二肽基羧肽酶活性[84]。将His110突变为Ala (H110A) 破坏His110和Asp22之间的盐桥，增加了“封闭环”的流动性，有助于胱抑素进入酶的活性部位，抑制Cath-B的活性[85]。删除Cath-B中的“闭塞环”片段(Cys108–Cys119残基)，并于毕赤酵母中表达得到二硫键缺失突变体M1。与野生型组织蛋白酶B相比，突变体M1仍具有内肽酶活性，但无外肽酶活性，且其对胱抑素的亲和力提高了40倍以上[86]。大多数组织蛋白酶B相关数据是通过研究动物获得的，关于植物组织蛋白酶B的酶学研究较少。植物组织蛋白酶B样蛋白酶的“闭塞环”比动物短，仅包含一个His残基[87]。从模式生物拟南芥Arabidopsis thaliana中鉴定出3个组织蛋白酶B：AtCathB1、AtCathB2和AtCathB3。AtCathB1缺乏水解活性，AtCathB2和AtCathB3具有水解活性和底物特异性。通过定点诱变获得两个AtCathB2突变体(G336E、H207A)，其中G336E改变了S2亚位点的底物结合特性，该突变体对Z-Arg-Arg-MCA底物的催化效率显著高于野生型。H207A能影响AtCathB2的内肽酶活性，其切割Z-Phe-Arg-MCA和Z-Arg-Arg-MCA底物的Kcat/Km值比野生型低50倍[88]。

除组织蛋白酶B之外，肝片吸虫组织蛋白酶L5中的L69Y突变可显著提高底物水解能力。组织蛋白酶L (Cath-L) 也属于类木瓜半胱氨酸蛋白酶超家族。成年肝片吸虫Fasciola hepatica分泌大量的组织蛋白酶L样蛋白酶，与组织入侵、摄食、免疫逃避或卵壳形成等活动有关，可作为合理设计疫苗的靶标[89-90]。肝片吸虫的组织蛋白酶L5 (FhCatL5) 是理论分子量为37.1 kDa的蛋白质，其对P2位置含有脯氨酸的底物没有显著的催化活性[91]。研究表明，组织蛋白酶L5中的单个氨基酸取代可以影响肝片吸虫组织蛋白酶的底物特异性。通过点突变构建了FhCatL5 (L69Y) 突变体，该突变体与野生型组织蛋白酶L5相比，裂解含P2脯氨酸的底物的能力显著提高[91]。

Guo等从嗜酸真菌Bispora sp. MEY-1中克隆了一个天冬氨酸蛋白酶基因Bsapa，并使其在毕赤酵母中成功表达[92]。重组BsAPA在pH 3.0和75 ℃时表现出最高的活性，在70 ℃及以下保持稳定，表明BsAPA具有较高的热稳定性。然而，热失活仍然限制了BsAPA的应用。为了进一步提高BsAPA的热稳定性，研究者对该酶自催化位点(Leu205–Phe206) 及其附近结构进行分析，并构建BsAPA突变体。与野生型相比，BsAPA的单位点突变体蛋白F193W、K204P、A371V在75 ℃下的半衰期分别提高了0.5倍、0.2倍和0.3倍，三位点突变体蛋白(F193W/K204P/A371V) 在80 ℃时半衰期增加了1.5倍，Tm提高了10.7 ℃[92]。该结果表明，天冬氨酸蛋白酶自催化降低了酶的热稳定性，对自催化位点附近定向诱变能够有效提高天冬氨酸蛋白酶热稳定性。

胶原蛋白是一种纤维蛋白，在生物结构中有重要作用，明胶是暂时存在组织中的变性胶原蛋白，与组织重塑、组织损伤引起的炎症有关[93-94]。可以用温和的酸处理提取胶原蛋白，并且在酸提取过程中添加蛋白酶可提高胶原蛋白的产量。明胶广泛用于食品、制药、化妆品等行业。猪Sus scrofa胃蛋白酶和人组织蛋白酶D具有高度的序列一致性，因此，通过定点突变改变猪胃蛋白酶的底物特异性，选择少数几个位点切割牛皮胶原可得到高质量的明胶[95]。野生型胃蛋白酶可以切割牛Ⅰ型胶原的多肽底物(SGGYDLSFLPQPPQE)，其切割位点主要位于Asp-Leu、Leu-Ser和Phe-Leu之间，但其切割Ser-Phe位点的速率明显较低。以Val和Met分别替代胃蛋白酶S2亚位点中的T222和E287获得双突变体蛋白T222V/E287M，该双突变体的Kcat/Km比野生型胃蛋白酶高2–4倍，其切割Ser-Phe的速率比野生型高20倍。双突变体蛋白F111T/L112F切割Leu-Ser位点的速率比野生型高23倍[96]。

脑卒中的形成与蛋白质C抑制剂氨基酸突变有关。脑卒中是导致儿童病死率增高的主要原因之一。脑卒中的形成可能与蛋白C抑制剂(Protein C inhibitor，PCI) 基因的改变有关。蛋白质C抑制剂是一种肝素依赖性丝氨酸蛋白酶抑制剂，存在于人血浆、尿液等体液中，除了能抑制蛋白C活性外，还可以抑制凝血酶、Xa因子、XIa因子、尿激酶等，在各物种的多个组织器官的血栓形成和止血中发挥着重要作用[97-98]。儿童卒中患者中蛋白质C抑制剂基因突变分析显示，第2外显子的核苷酸6760处存在G到A的错义突变，导致Ser突变为Asn (S188N)，在该儿童父亲和其他骨髓移植后卒中儿童中也发现了同样的改变[99]。

鸡卵粘蛋白存在于鸟类的蛋清中，对多种丝氨酸蛋白酶有抑制作用。鸡卵粘蛋白(Chicken ovomucoid，OMCHI) 由3个串联重复的Kazal同源结构域组成，分别是第一结构域OMCHI1 (1–68)、第二结构域OMCHI2 (65–130)和第三结构域OMCHI3 (131–186)，每个结构域都有一个抑制丝氨酸蛋白酶的实际或假定反应位点[100]。目前以OMCHI3的研究最为广泛，将其P1位点残基Ala16替换为Met或Lys位点，突变体A16M和A16K分别获得了对胰凝乳蛋白酶和胰蛋白酶的抑制活性，提示P1位点是抑制特异性的主要决定因素[101]。

笔者所在研究团队从家蚕基因组序列鉴定出80个丝氨酸蛋白酶抑制剂(SPI) 基因，分别命名为BmSPI1–BmSPI80，从这些丝氨酸蛋白酶抑制剂中共鉴定到10种SPI结构域(Serpin、Kunitz_BPTI、Kazal、TIL、Amfpi、Bowman-Birk、Antistasin、WAP、Pacifast和Alpha-macroglobulin)[102]。进一步研究发现，家蚕丝氨酸蛋白酶抑制剂BmSPI38和BmSPI39具有一个独特的TIL (Trypsin inhibitor- like cysteine-rich domain) 结构域，它们能够抑制球孢白僵菌分泌的毒力蛋白酶CDEP-1的活性，抑制球孢白僵菌分生孢子的萌发，增强家蚕的抗真菌能力[103-104]。蚕丝中含有丰富的蛋白酶抑制剂，以BmSPI39为代表的TIL类蛋白酶抑制剂可以随泌丝过程进入茧层中，赋予蚕茧很强的抗微生物蛋白酶水解特性，为茧中蛹的发育提供长效保护[105-108]。多数TIL家族蛋白酶抑制剂的TIL结构域中含有10个保守的Cys残基，形成5对二硫键，抑制胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、弹性蛋白酶等哺乳动物源的蛋白酶[109-111]。而笔者研究发现，BmSPI37、BmSPI38和BmSPI39的TIL结构域中缺少第2位和第6位Cys残基，它们皆可强烈抑制微生物蛋白酶活性，但对胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶和弹性蛋白酶无抑制作用[112-113]。众所周知，丝氨酸蛋白酶抑制剂的抑制特异性通常由其反应中心的P1氨基酸残基决定，因此，通过替换P1残基来改变抑制特异性是蛋白酶抑制剂的共同特征。然而，日本学者将BmFPI-F的P1残基Thr29替换为不同理化性质的氨基酸(Glu、Arg、Gly、Leu、Met和Phe) 没有改变其抑制特异性，该抑制剂也是带有一个含有8个保守的半胱氨酸残基的TIL结构域[114]。因此，笔者推测除P1残基以外其他氨基酸也可能决定TIL型蛋白酶抑制剂的特异性。生物信息学分析提示BmSPI38和BmSPI39中的Cys2nd和Cys6th缺失可能是它们获得对微生物蛋白酶抑制活性的重要原因。因此，笔者通过定点突变技术在BmSPI38和BmSPI39相应位点引入Cys2nd和Cys6th，结果显示Cys的引入不仅会影响BmSPI38和BmSPI39的多聚化状态，还会显著降低它们对微生物蛋白酶的抑制活性[112]。突变前后的BmSPI39三维结构分析显示，两个二硫键桥(D38C-L58C和C40-C54) 形成一个稳定的刚性区域，P1残基A56位于中间，使BmSPI39 (D38C/L58C) 反应中心的柔性降低，进而影响其抑制特异性和活性[112]。进一步对已报道的TIL类蛋白酶抑制剂序列特征和活性进行系统归纳，发现该类抑制剂的抑制特异性是有一定规律的，TIL类蛋白酶抑制剂的抑制活性和特异性可能由这两个缺失的半胱氨酸(Cys2nd和Cys6th) 和反应中心中P1和P1′氨基酸残基的理化性质共同决定[112]。有鉴于此，笔者在引入或不引入Cys2nd和Cys6th的基础上对BmSPI38和BmSPI39中的P1和P1′残基进行了饱和突变，现已取得一些可喜的研究进展，获得突变体蛋白200余个，有望实现TIL类蛋白酶抑制剂活性和特异性的定向改造(数据尚未发表)。

人胱抑素C (Human cystatin C，HCC) 属于胱抑素超家族Ⅱ亚家族，是分子量相对较小的碱性单链淀粉样蛋白，能有效抑制半胱氨酸蛋白酶，参与免疫调节和细胞凋亡，与人类肿瘤恶性发展相关，可作为药物开发研究的生物标志物[115-117]。HCC通过三维结构域(α-螺旋，两个β链和L1环) 交换机制形成二聚体而失去抑制活性，HCC中Val57残基位于L1环顶部，可能是二聚体形成的关键[118-119]。用Asn、Asp和Pro替换Val57残基后发现，V57D和V57N突变降低二聚体形成，而V57P突变可有效地形成二聚体。其中，V57D突变增强了L1环的稳定性，使HCC分子保持单体形式，从而保持其对木瓜蛋白酶的抑制活性[120-121]。引入一个新的二硫键桥(L47C-G69C) 可消除三维结构域交换，从而实现其单体状态的稳定性，该突变体显著降低了HCC二聚体化作用和蛋白酶原纤维形成，但不改变对木瓜蛋白酶的抑制作用[122]。

此外，家蚕中也有半胱氨酸蛋白酶抑制剂关键活性位点的研究报道。家蚕Serpin18实为一种独特的半胱氨酸蛋白酶抑制剂。典型的丝氨酸蛋白酶抑制剂Serpins构象包括9个α-螺旋、3个反平行β-折叠片和1个反应中心环(Reactive center loop，RCL)。RCL位于羧基末端附近，由约20个氨基酸组成，充当蛋白酶结合和切割的诱饵。笔者所在研究团队发现Serpin18的RCL只有13个氨基酸，比典型Serpins短约7个氨基酸，因此推测Serpin18具有独特的靶向特异性[123]。用胰蛋白酶、糜蛋白酶、弹性蛋白酶、枯草杆菌素、蛋白酶K和木瓜蛋白酶与抑制剂一起孵育后发现，Serpin18对丝氨酸蛋白酶几乎没有抑制活性，但对木瓜蛋白酶的水解活性达到90%，表明Serpin18可能是一种半胱氨酸蛋白酶抑制剂，而非丝氨酸蛋白酶抑制剂[124]。丝素酶是一种组织蛋白酶L样半胱氨酸蛋白酶，Serpin18可以抑制丝素酶活性，提示其可能在家蚕发育过程中通过调节丝素酶活性来保护丝蛋白免受降解[124-125]。对反应中心的3个暴露残基(Ser360、Val361和Val362) 进行定点突变，与野生型相比，S360A和V361G突变体的抑制活性变化不大，而V362G和V362T突变体的抑制活性显著降低[124]。

Sorsby眼底营养不良(Sorsby fundus dystrophy，SFD) 是一种中枢视网膜的常染色体显性遗传病，由金属蛋白酶组织抑制剂TIMP3基因突变引起[126]。SFD主要影响脉络膜，可引发脉络膜新生血管萎缩，形成严重的视力损害，而脉络膜是一种基底膜与细胞外基质组成的多层结构[127-128]。TIMP是基质金属蛋白酶(MMPs) 的天然抑制剂，调节MMPs和细胞外基质之间的平衡。小鼠TIMP3是由211个氨基酸组成的分泌蛋白，具有12个进化上保守的Cys残基，形成6个分子内二硫键桥[129]。TIMP3在决定细胞形态的通路中发挥功能，TIMP3中特定位点突变(S156C、G166C、G167C、Y168C、S181C) 会导致该蛋白羧基端可能存在未配对的Cys残基，从而使TIMP3丧失功能，引发SFD[130-131]。在一个SFD家族中发现了新的错义突变(H158R)，并且该突变不会产生未配对的半胱氨酸残基[132]。已有研究证实，His158是大多数脊椎动物TIMP同源物中进化保守的残基，H158R突变会破坏TIMP3的功能[132]。总之，对TIMP3关键位点异常突变的研究有助于进一步了解SFD的发病机制。

凝血是防止受伤过程中过度失血的重要生理过程，凝血可分为3种途径：内在途径、外在途径和共同途径。内源性凝血因子作为开发低出血风险抗凝药物的替代靶点，已越来越受到研究人员的关注[133-134]。从金环蛇Bungaus fasciatus的毒液中分离鉴定的Kunitz-type丝氨酸蛋白酶抑制剂Fasxiator能够选择性地抑制人凝血酶FXIa的活性[135]。通过选择性点突变设计了一系列突变体以提高重组Fasxiator的抑制活性和特异性。与野生型相比，突变体N17R和L19E抑制活性提高了约1 000倍，突变体在人血浆中的抗凝活性比在小鼠血浆中的强10倍左右，还可以延长FeCl3致血栓形成模型小鼠的颈动脉闭塞时间[135]。

猪蛔虫Ascaris suum主要感染猪，但也会引起人类疾病。作为其在宿主肠道生存机制的一部分，猪蛔虫会产生许多蛋白酶抑制剂，包括分子量为17 kDa胃蛋白酶抑制剂-3 (Pepsin inhibitor-3，PI3)[136]。PI3可竞争性的抑制胃蛋白酶、胃亚蛋白酶和组织蛋白酶等天冬氨酸蛋白酶活性。PI3-猪胃蛋白酶复合体三维结构显示，PI3与酶有两个接触区域。PI-3的氨基端前3个残基(QFL) 可以与胃蛋白酶的活性位点裂隙一侧的氨基酸残基70–82配对，并且PI-3羧基端多脯氨酸螺旋(残基138I–142I) 可以与胃蛋白酶的羧基端结构域中β-发夹环(残基289–294) 形成范德华接触[137]。对这两个区域进行突变分析以评估它们对PI3的结合亲和力的贡献，结果表明，总体上多脯氨酸突变(P143A) 对所有测试的天冬氨酸蛋白酶的Ki值影响比较有限。相较于野生型，Q1L突变体对恶性疟原虫的血浆蛋白酶(PfPM2) 的Ki值降低了200倍[138]。

蛋白酶及其抑制剂与生物体生命活动密切相关，广泛应用于农业、工业以及医疗行业。蛋白酶及其抑制剂的突变会影响其生物学效应，对蛋白酶及其抑制剂的关键活性位点进行分析，不仅有利于深化人们对其活性作用机制的认识，还有助于其生物工程改造及应用。笔者对已报道的蛋白酶(表 1) 和蛋白酶抑制剂(表 2) 的关键活性位点研究进行了简要汇总，发现氨基酸突变大多发生在蛋白酶的催化位点和蛋白酶抑制剂的反应中心附近，随之引起生理功能失调或活性改变。目前，定点突变依然是进行蛋白酶及其抑制剂活性改造的有效手段之一。活性改造不仅可以提高蛋白酶的催化效率和稳定性，也可以改变蛋白酶抑制剂的抑制活性和特异性。大量的研究显示，蛋白酶关键活性位点主要分布于催化位点和底物结合位点，蛋白酶抑制剂关键活性位点主要存在于反应中心内。除此之外，多聚体蛋白的相互作用界面、维持蛋白刚性结构的二硫键桥、游离的Cys残基等都可能影响蛋白酶抑制剂的活性和抑制特异性，但相关研究报道较少，还需进一步探究。

蛋白酶活性失调与许多人类疾病有关，蛋白酶关键位点突变可作为干预疾病治疗的靶点，并且有利于开发新型蛋白酶抑制剂。关键活性位点分析不仅有助于了解发病机制，更有利于在医药领域上针对性地进行新药设计和研制。因此，与人类疾病预防和药物开发有关的蛋白酶关键活性位点研究始终是炙手可热的研究热点。此外，蛋白酶及其抑制剂在食品工业上的应用也非常重要，主要体现在调节蛋白酶的水解效率和稳定性上，有利于提高食品安全性和降低成本。因此，基于蛋白酶及其抑制剂的结构深入研究其关键活性位点，进而对蛋白酶和蛋白酶抑制剂进行生物工程改造，实现医药和食品上的生产应用是具有广阔发展潜力的研究方向。除此之外，蛋白酶及其抑制剂关键活性位点分析和改造在农林害虫防治等方面还有待进一步研究。迄今为止，有关蛋白酶关键活性位点的研究比蛋白酶抑制剂关键活性位点的研究更加丰富和深入，提示蛋白酶抑制剂关键活性位点研究还有着巨大的可挖掘空间。笔者对家蚕TIL类蛋白酶抑制剂关键活性位点的研究已经取得一些可喜的研究进展，有望实现TIL类蛋白酶抑制剂活性和特异性的定向改造。本文对近年来蛋白酶及其抑制剂关键活性位点研究进行了简要综述，可为蛋白酶和蛋白酶抑制剂的生物学活性改造和应用提供理论基础。