半夏系天南星科半夏属草本植物, 药用部位为块茎, 性味辛温, 有毒, 归肺、脾、胃经, 抗肿瘤, 具有重要的药用价值[1]。在我国西部地区, 干旱是半夏生产中的主要逆境因子之一[2], 影响半夏生长、抗氧化生理指标[3, 4]及体内有机物的积累, 严重干旱致使半夏的非生理性倒苗, 降低半夏的产量和生物量[5]。此外, 干旱胁迫对半夏中的药用成分的积累和质量也产生了显著影响[6, 7], 同时也调控植物的氮代谢, 对半夏的生理过程有着重要的影响。氮代谢在无机氮转化为有机氮过程中发挥着重要作用, 对植物体内各种氨基酸和次生代谢底物的积累有着明显的影响。半夏生物碱是主要药用成分之一, 干旱对半夏生物碱积累的调控有着紧密的联系。同时, 氮素的形态对半夏的化学成分有着显著的影响[8, 9], 因而研究不同程度土壤干旱对半夏有效成分含量与氮代谢关键酶活性的关系, 以期从氮代谢方面探讨干旱对半夏总生物碱的调控机制, 并了解半夏生物碱的合成与积累的机理, 可以为提高半夏的品质和有效成分含量提供科学参考依据。现将有关结果总结如下 。

半夏块茎由甘肃省清水县农业局试验基地提供, 经浙江理工大学生命科学学院梁宗锁教授鉴定为天南星科植物半夏[Pinellia ternata(Thunb.)Breit]块茎, 2017年3月种于浙江理工大学植物科学楼楼顶, 选取长势和叶型一致的半夏移栽于盛有充分混匀的介质(田园土: 沙子为3: 1, V/V)的塑料桶中, 每盆10棵, 干旱处理通过自然干旱和称重法进行控制, 土壤饱和含水量为25.47%, 干旱程度设置按照张红敏[5]的方法。设置CK为对照组, 土壤含水量保持在80%为适宜水分含量; D1组为轻度干旱, 土壤含水量为65%左右; D2组为中度干旱, 土壤含水量为50%左右。在干旱处理的第7, 14, 21, 28, 35天采样, 每个处理组随机采样10株, 3次重复, 进行各项指标测定。分别在第7天和第35天, 取半夏块茎, 去皮, 烘干, 打粉, 用于测定总生物碱。

1.2.1 硝酸还原酶、谷氨酸合成酶、谷氨酰胺合成酶、苯丙氨酸解氨酶活性的测定

硝酸还原酶(nitrate reductase, NR)的测定采用活性离体法[10], 以每1 mg蛋白质在1 h内还原KNO3所形成的N O2-质量(μ g)表示。谷氨酸合成酶(glutamate synthase, GOGAT)活性的测定参照赵全志等[11]的方法。谷氨酰胺合成酶(glutamine synthetase, GS)活性测定参照汤章诚[12]的方法。苯丙氨酸解氨酶(phenylalanine ammonia-lyase, PAL)活性测定方法参照孙健玲[13]的方法。

1.2.2 总生物碱测定

以盐酸麻黄碱为对照品, 绘制作标准曲线方程Y=0.007 5X+0.025 2 (R2=0.992 4), 横坐标(X)为盐酸麻黄碱浓度(μ g· mL-1), 纵坐标(Y)为吸光度。称取半夏块茎粉末0.5 g, 放置三角瓶中, 再加10 mL氯仿, 0.5 mL浓氨水, 冷浸3 h, 超声1 h, 过滤提取液, 残渣用10 mL 氯仿洗涤, 重复3次(4、3、3 mL), 合并滤液。滤液旋蒸至干, 再用氯仿溶解并定容于10 mL 量瓶中。将溶液转移至25 mL分液漏斗中, 依次加入10 mL柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液(pH值5.4)和1 mL 0.05%溴麝香草酚蓝溶液, 充分振摇1 min, 静置萃取1 h, 分取氯仿层, 水层再用10 mL氯仿萃取两次, 合并氯仿, 50 ℃回收至干, 用10 mL氯仿洗涤残留物, 重复3次(4、3、3 mL), 滤液转入10 mL量瓶中, 氯仿定容, 作为供试液[14]。

1.2.3 数据处理

所有指标生物学重复测定3次, 数据采用SPSS 20.0进行统计分析和方差检验, 结果以平均值± 标准误差表示。

2.1.1 叶片中NR活性

NR作为氮代谢途径中的第一个酶, 主要是催化N O3-生成N H4+。由图1可知, 半夏叶片中的NR活性先升高, 后降低, 在第14天达到最大含量。在第7天、21天和35天, 相较于CK处理, D1处理的NR活性分别增加了24.36%、45.34%和17.45%, D2处理的NR活性分别增加了27.73%、45.44%和8.69%, D1和D2处理与对照达到显著性差异, D1和D2处理之间差异不显著。在处理的第14天, 与CK比较, 在3个处理中, D1处理的NR活性增加了102.5%, D2处理的NR活性增加了157.97%, D1和D2处理与对照达到显著性差异, D1和D2处理之间也差异显著。NR在中度干旱的条件下, 活性最大。由此说明, 随着干旱程度的增加, 半夏叶片的NR活性提高, 有利于N O3-同化为N H4+, 有利于氮素的同化。

2.1.2 叶片中GS活性

GS是GS/GOGAT循环途径的第一个酶, 催化氨基与谷氨酸结合, 生成谷氨酰胺, GS的活性与氨的代谢速度密切相关。由图2可知, 随着干旱胁迫时间的增加, GS活性呈先增加后减少的趋势, 在第14天达到最大。相较于适宜水分, 轻度干旱和中度干旱处理下的半夏叶片GS的活性保持较高水平。在第7天, 相较于CK, D1和D2处理的GS活性达到显著性差异, 而D1和D2处理之间的差异较小, D2处理的GS活性高于D1处理。在处理的第14天, 相较于CK, D1和D2的GS活性分别增加了49.54%和208.87%, 差异显著。GS活性表现为D2> D1> CK, 较高的GS活性加快了N H4+的同化, 为氨基酸合成提供氨基, 为次生代谢物提供了前体物质。

2.1.3 叶片中GOGAT活性

GOGAT是氮素同化过程中的关键酶, 催化谷氨酰胺的氨基转移到α -酮戊二酸上, 形成谷氨酸, GS/GOGAT偶联形成的是高等植物氨同化的主要途径, 在无机氮转化为有机氮的过程中起关键作用。由图3可知, 总体趋势上, GOGAT活性的变化呈先升高后降低的趋势, 干旱处理组GOGAT活性始终高于适宜水分处理。在处理第21天, GOGAT活性最大, 相较于CK, D1、D2处理的GOGAT活性分别增加了31.55%、37.02%, 差异显著, D1与D2处理之间差异也达到显著水平。随着时间的延长, 相较于适宜水分条件, 轻度干旱和中度干旱处理下半夏叶片GOGAT活性始终保持较高水平。在中度干旱条件下, 半夏体内的GOGAT活性最高, 有利于半夏N H4+的同化。

2.1.4 叶片中PAL活性

PAL是半夏生物碱合成途径中的重要酶, 活性的强弱显示生物碱合成的强弱。随着处理时间的延长, PAL的活性逐渐降低。在第7天, D2处理条件下的PAL活性高于CK、D1处理, 而在第14天以后, 相较于CK, D1和D2处理的PAL活性保持较高的水平。D1和D2处理之间差异不显著。在第28天, 相较于CK, D1和D2处理的PAL活性分别增加了58.27%和53.44%。由图4可知, 在干旱条件下, PAL活性保持较高的水平, 有利于半夏生物碱的积累。

由图5可知, 在干旱胁迫的第7天, 轻度干旱和中度干旱胁迫下半夏块茎总生物碱要高于适宜水分处理, 分别增加了34.10%和37.49%, 差异不显著。在处理的第35天, 相较于对照处理, 轻度干旱和中度干旱处理下的半夏生物碱含量分别增加了2.23倍和2.28倍。说明, 中度和轻度干旱有助于生物碱含量的积累, 提高了半夏的质量。

氮代谢是植物获得氮的主要途径, 主要是无机氮向有机氮的转化, 有机含氮化合物的合成及其之间的相互转化, 也为次生代谢产物的合成提供了底物。生物碱也是含氮的碱性化合物, 因而从氮代谢方面探究生物碱的合成与积累具有一定的理论指导意义。硝酸还原酶NR是参与氮代谢途径中第一步反应的酶, 同时也是限速酶, 催化N O3-还原, 同时, NR可直接调节N O3-的还原, 对于调控氮代谢进程发挥着重要的作用[15]。干旱条件下, NR随着干旱程度的加剧逐渐升高, 是NR对半夏在干旱胁迫下的补偿作用, 有助于半夏还原N O3-, 生成N H4+, N H4+的增多, 促进了GS和GOGAT对N H4+的同化。N H4+进入GS/GOGAT循环[16], 首先由GS催化谷氨酸与N H4+结合, 生成谷氨酰胺; 然后由GOGAT将谷氨酰胺的氨基与α -戊二酸结合, 合成谷氨酸, 新合成的谷氨酸可用于合成其他氨基酸或者作为次生代谢物的底物[17]。中度干旱和轻度干旱促进了N H4+的同化, 有助于合成更多的苯丙氨酸等氨基酸。苯丙氨酸解氨酶PAL是半夏生物碱合成途径中的关键酶[18], 探讨PAL与生物碱积累的关系, 有目的地通过基因改造获得高产高生物碱的半夏品种成为当前研究的重要方向[19]。随着干旱胁迫的逐渐加剧, 刺激了PAL基因的表达, PAL活性的增加, 加快苯丙氨酸的转化为反式肉桂酸, 促进了生物碱合成, 促进了半夏在轻度和中度干旱条件下生物碱的积累。

中度干旱和轻度干旱胁迫下, 半夏块茎积累了较多的总生物碱。在以组培苗作为次生代谢的研究中, 半夏组培苗体内PAL、GOGAT、GOT活性在外源NO刺激下得到提高, 加速了无机氮向有机氮的转化, 供给更多的代谢前体物以促进总生物碱积累[20, 21]。在半夏愈伤组织中, 添加物苯丙氨酸、天冬氨酸、硝普钠、乙酰水杨酸单独或两两复合, 使得氮代谢的关键酶以及生物碱含量都有增加, 因而推测外源添加物能通过调节氮代谢相关酶的变化, 从而影响半夏愈伤组织中总生物碱的含量[22]。通过本研究, 半夏在轻度干旱和中度干旱的条件下, NR、GOGAT、GS的活性提高, 有利于无机氮的转化和有机氮的同化, 促进氮代谢的进行, 合成次生代谢必要的氨基酸, 再通过PAL催化苯丙氨酸, 积累较多的次生代谢前提物质, 从而有利于半夏次生代谢产物的增加。

目前, 半夏作为我国重要的药用植物, 其生物碱是重要的天然药用成分。然而干旱条件下半夏易倒苗、产量降低, 同时影响半夏生物碱的积累, 本文研究了半夏在干旱胁迫下的生理代谢的变化, 结果表明, 中度干旱下半夏氮代谢关键酶和PAL活性保持较高的水平, 促进氮代谢的进程, 有利于生物碱的合成与积累。研究干旱胁迫对半夏生物碱合成与积累的调节机理, 对提高半夏药用成分含量有着指导意义, 不仅为干旱地区种植半夏提供理论指导, 还对半夏的节水种植有着积极的生产价值。现阶段对半夏生物碱代谢途径的研究有待完善, 半夏的品质对其生物碱药用价值有着重要的联系, 进一步研究半夏生物碱的合成途径有着十分重要的意义。

The authors have declared that no competing interests exist.