蛋白质检测方法汇总

本实验的目的是学会各种蛋白质含量的测定方法。

了解各种测定方法的基本原理和优缺点。

蛋白质含量测定法，是生物化学研究中最常用、最基本的分析方法之一。目前常用的有四

种古老的经典方法，即定氮法，双缩尿法（

Biuret

法）

、

Folin

－酚试剂法（

Lowry

法）和紫

外吸收法。另外还有一种近十年才普遍使用起来的新的测定法，即考马斯亮蓝法（

Bradford

法）

。其中

Bradford

法和

Lowry

法灵敏度最高，比紫外吸收法灵敏

10

～

20

倍，比

Biuret

法

灵敏

100

倍以上。

定氮法虽然比较复杂，

但较准确，

往往以定氮法测定的蛋白质作为其他方

法的标准蛋白质。

值得注意的是，这后四种方法并不能在任何条件下适用于任何形式的蛋白质，因为一种蛋

白质溶液用这四种方法测定，有可能得出四种不同的结果。每种测定法都不是完美无缺的，

都有其优缺点。

在选择方法时应考虑：

①实验对测定所要求的灵敏度和精确度；

②蛋白质的性质；

③溶液中存在的干扰物质；

④测定所要花费的时间。

考马斯亮蓝法（

Bradford

法）

，由于其突出的优点，正得到越来越广泛的应用。

一、微量凯氏（

Kjeldahl

）定氮法

样品与浓硫酸共热。含氮有机物即分解产生氨（消化）

，氨又与硫酸作用，变成硫酸氨。经

强碱碱化使之分解放出氨，

借蒸汽将氨蒸至酸液中，

根据此酸液被中和的程度可计算得样品

之氮含量。若以甘氨酸为例，其反应式如下：

CH2COOH 

| 

+ 3H2SO4--------- 2CO2 + 3SO2 +4H2O +NH3 

(1) 

NH2 

2NH3 + H2SO4 -------- ---(NH4)2SO4 

(2) 

(NH4)2SO4 + 2NaOH ----------- 2H2O +Na2SO4 + 2NH3 

(3) 

反应（

1

）

、

(2)

在凯氏瓶内完成，反应（

3

）在凯氏蒸馏装置中进行。

为了加速消化，可以加入

CuSO4

作催化剂，

K2SO4

以提高溶液的沸点。收集氨可用硼酸溶

液，滴定则用强酸。

实验和计算方法这里从略。计算所得结果为样品总氮量，如欲求得样品

中蛋白含量，

应将总氮量减去非蛋白氮即得。

如欲进一步求得样品中蛋白质的含量，

即用样

品中蛋白氮乘以

6

．

25

即得。

五种蛋白质测定方法比较如下：

方法

灵敏度

时间

原理

干扰物质

说明

凯氏定氮法（

Kjedahl

法）

灵敏度低，适用于

0.2~ 1.0mg

氮，误差为

±

2

％

费时

8

～

10

小时

将蛋白氮转化为氨，用酸吸收后滴定

非蛋白氮（可用三氯乙酸沉淀蛋白质

而分离）

用于标准蛋白质含量的准确测定；干扰少；费时太长

双缩脲法（

Biuret

法）

灵敏度低

1

～

20mg 

中速

20~30

分钟

多肽键＋碱性

Cu2

＋

?

紫色络合物

硫酸铵；

Tris

缓冲液；某些氨基酸

用于快速测定，但不太灵敏；不