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作者：

张晊瑞

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摘要：

背景巨噬细胞是一种角膜本地居留的免疫细胞,在真菌性角膜炎过程中,巨噬细胞数量随着病变进程逐渐增多,提示巨噬细胞在真菌性角膜炎疾病发展中起着重要作用.但目前,巨噬细胞与真菌的相互作用尚无深入的研究.目的探讨小鼠巨噬细胞是否对真菌(腐皮镰孢菌)有吞噬作用,巨噬细胞是否可杀灭(或抑制)真菌,而真菌是否也对巨噬细胞有细胞毒(或促增殖)作用.材料与方法取巨噬细胞(RAW 264.7)与真菌孢子(腐皮镰孢菌)共培养,连续拍照并观察视野中巨噬细胞对真菌孢子的吞噬现象及被吞噬孢子的出芽数;取真菌孢子一部分单独培养,一部分与小鼠巨噬细胞(RAW 264.7)共培养,后不同时间点随即选取视野计数孢子总数和出芽孢子数,计算真菌孢子出芽率,即:真菌出芽率=出芽孢子数/孢子总数×100%;取孢子悬液一部分单独培养,一部分与小鼠巨噬细胞(RAW 264.7)共培养,后不同时间点稀释孢子悬液1000倍后,平铺于马铃薯葡萄糖琼脂培养皿中,48h后计数菌落形成单位;取巨噬细胞与不同浓度真菌孢子共培养,后不同时间点加入CCK 8试剂,4h后使用酶标仪测定活细胞光密度值.结果对同一视野巨噬细胞和真菌孢子的观察可见,巨噬细胞可捕捉并吞噬真菌孢子,但被吞噬的真菌孢子可在胞内继续生长,且被吞噬的所有真菌孢子均100%出芽生长.真菌孢子与巨噬细胞共培养后在1h,2h,3h,4h,5h,6h,7h,8h时,共培养组出芽率分别为:(0.24±1.06)%,(1.15±2.33)%,(10.99±5.70)%,(34.31±6.95)%,(46.79±8.29)%,(59.42±12.88)%,(65.77±9.63)%,(73.03±6.15)%;单纯孢子组为:(0.38±1.67)%,(2.76±1.06)%,(22.4±10.49)%,(54.92±5.85)%,(71.36±6.94)%,(80.12±7.24)%,(91.62±6.16)%,(97.25±8.20)%.在3h,4h,5h,6h,7h,8h时,两组差异均有统计学意义(P0.05),在1h,2h时,差异无统计学意义(P0.05).真菌孢子与巨噬细胞共培养后在2h,4h,6h,8h,10h,12h时,共培养组的菌落数分别为:44.46±0.68×10~4个,41.74±0.67×10~4个,38.63±0.52×10~4个,37.57±0.70×10~4个,37.57±0.70×10~4个,36.59±0.50×10~4个,35.72±0.66×10~4个,与单纯孢子组相比各时间点差异均有统计学意义(P0.05).灭活真菌孢子与巨噬细胞共培养后,在1h,2h,3h,4h,5h,6h,7h,8h时,不同浓度孢子组与PBS组相比,差异均有统计学意义(P0.05);同一时间点各不同浓度孢子组相比,差异无统计学意义(P0.05).同一浓度孢子组各时间点相比,差异无统计学意义(P0.05).结论巨噬细胞与真菌孢子(腐皮镰孢菌)共培养后,观察发现巨噬细胞可吞噬真菌孢子,但并未破坏真菌;真菌孢子出芽率和CFU数降低,巨噬细胞增殖明显.这表明巨噬细胞能吞噬真菌孢子并抑制其生长,反之真菌孢子可促巨噬细胞增殖.背景在机体炎症反应中,巨噬细胞,异物菌种及中性粒细胞等常同时存在,互相作用产生复杂的炎症反应.因此检测巨噬细胞吞噬能力可间接反映机体免疫应答的能力.本实验前期研究发现,巨噬细胞对不同异物的吞噬能力存在差别.而目前多数研究评价巨噬细胞的吞噬能力,常使用乳胶颗粒作为实验对象,而乳胶颗粒是否能代表其他多种异物,准确评价巨噬细胞的吞噬能力,还有待进一步研究.目的比较巨噬细胞体外吞噬功能常用研究方法(乳胶颗粒)与吞噬具体真菌病原体,中性粒细胞的异同.客观比较和评价乳胶颗粒法的可行性.材料与方法取小鼠巨噬细胞分别与乳胶颗粒,灭活真菌孢子,中性粒细胞共培养,在2h,4h,6h,8h时分别计数巨噬细胞总数及吞噬异物的巨噬细胞数,每视野被吞噬异物数.计算巨噬细胞吞噬率和吞噬指数,结果以中位数统计方法表示.结果在8h时,巨噬细胞对灭活真菌孢子的吞噬率最高达22.73%(18.78%,28.04%),中性粒细胞次之为18.75%(14.46%,23.20%),乳胶颗粒最低为12.50%(10.71%,13.79%),各组较2h相比,差异均有统计学意义(P0.05);与乳胶颗粒组相比,各时间点差异有统计学意义(P0.05).在8h时,巨噬细胞对灭活真菌孢子的吞噬指数为0.30(0.23,0.31),中性粒细胞为0.21(0.16,0.28),乳胶颗粒为0.14(0.12,0.18),各组较2h相比,差异均有统计学意义(P0.05);与乳胶颗粒组相比,2h,6h,8h差异有统计学意义(P0.05),4h差异无统计学意义(P0.05).结论小鼠巨噬细胞对乳胶颗粒,灭活真菌孢子,中性粒细胞的吞噬能力随共培养时间增加而增高,但吞噬能力存在明显差异.因此单纯使用常用的乳胶颗粒作为指标来评价巨噬细胞的吞噬能力是不准确,不全面的.

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关键词：

巨噬细胞；腐皮镰孢菌；出芽率；菌落形成单位；CCK 8活性实验；RAW 264.7小鼠巨噬细胞；腐皮镰孢菌；乳胶颗粒；中性粒细胞；吞噬率；吞噬指数

DOI：

CNKI:CDMD:2.1017.258190