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作者：

王英芳

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摘要：

研究目的: 唾液酸结合免疫球蛋白样凝集素(sialic-acid-binding-immunoglobulin-like lectins,siglec)最初被认定为细胞表面的跨膜受体,特异性表达于各种免疫细胞和造血细胞表面,能够抑制TIR信号,因此作为诊断和治疗各种疾病的高生物标记物引起了人们的关注.其家族的成员之一,siglec-E(与人同源的是siglec-7和siglec-9),主要表达于巨嗤细胞和中性粒细胞表面,是急性炎症反应的重要负调节因子,是脓毒症治疗的潜在靶点.每年有800万患者因脓毒症而死亡,脓毒症仍是大部分住院患者最主要的死因,目前现有的治疗方法仍不是很有效.脓毒症时巨噬细胞的增殖,活化,功能状态对脓毒症的发展预后具有重要的作用.本研究通过LPS对小鼠RAW264.7单核巨噬细胞进行干预,观察脓毒症相关的siglec-E在巨噬细胞的表达及释放规律,摸索出较为合适的刺激浓度和作用时间,进一步探讨其与巨噬细胞分化和吞噬功能改变的关系,以及脓毒症时巨噬细胞吞噬功能障碍的机制,从而阐明:LPS诱导巨噬细胞表达和释放siglec-E的规律以及其对巨噬细胞极化的影响,对脓毒症发生发展和预后的影响,寻找新的有效的治疗脓毒症的方法. 研究方法: (1)常规培养小鼠RAW264.7单核/巨噬细胞株,选取对数期细胞,以2x106个/ml细胞密度接种,分别设置对照组和实验组.对照组不予处理,实验组予以LPS刺激,在不同的时间点(Oh,6h,12h,24h,36h,48h)分别提取对照组和实验组细胞的总RNA和总蛋白.通过实时荧光定量PCR法检测细胞裂解液中siglec-EmRNA表达量;通过Western blot法检测胞质中siglec-E蛋白含量. (2)常规培养小鼠RAW264.7单核/巨噬细胞株,选取对数期细胞,以2x106个/ml细胞密度接种,分别设置对照组和实验组.对照组不予处理,实验组细胞分别加入不同浓度的LPS(0.01ug/ml,0.1ug/ml,1ug/ml,2ug/ml)刺激,孵育24h后,分别提取对照组和实验组细胞RNA和总蛋白.通过实时荧光定量PCR法检测细胞裂解液siglec-EmRNA表达;通过Western blot法检测胞质中siglec-E蛋白含量. 结果: (1)在 LPS刺激下,不同时间点的siglec-EmRNA表达量同对照组相比逐渐增加,6h~12h的表达量增加不明显,12h~36h的表达量明显增加,而36h?48h的表达量增加缓慢;siglec-E蛋白的表达量亦是如此. (2)不同剂量的LPS刺激下,siglec-E的mRNA表达量同对照组相比增高,在给予刺激浓度为0.01ug/ml?0.1ug/ml时的表达量明显增多,但增加速度缓慢;而在0.1ug/ml~1ug/ml时表达量明显增加,但在1ug/ml~2ug/ml浓度时表达量却有所下降;siglec-E的蛋白表达量与此大致一致. 结论: (1)不同剂量的LPS刺激小鼠RAW264.7单核/巨噬细胞,可促进其表面siglec-E表达量增加,在0.01ug/ml~1ug/ml范围内表达量是增加的,但在1ug/ml的浓度时表达量显著,而在高于1ug/ml浓度下则产生了抑制,表达量下降. (2)LPS刺激后,随干预时间延长,小鼠单核巨噬细胞RAW264.7表面siglec-E表达量逐渐增加,在6h?48h之间表达量都是增加的,在48h时间点表达量最为显著. (3)siglec-E2在脓毒症炎症时表达量增加且呈现一定的时间和剂量依赖.

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关键词：

脓毒症 血清脂肪酶 巨噬细胞 唾液酸结合免疫球蛋白样凝集素 细胞极化

学位级别：

硕士

学位年度：

2017