Maxima 反转录酶 |
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Maxima H Minus 反转录酶经分子改造技术引入有利突变并筛选获得,与野生型M-MuLV酶相比,其热稳定性、持续合成能力和扩增活性均有明显提高。这些特性使其可在不同模板的反转录中提供更高的 cDNA 产量,以及对具有复杂二级结构 RNA 模板的高效 cDNA 合成。 同时 Maxima H Minus 反转录酶可以更高效地合成全长 cDNA 。在 cDNA 合成中,RNase H 会降解 RNA-DNA 复合体中的 RNA 模板;由于该酶 RNase H 活性缺失,所以有助于防止 RNA 模板的过早降解。在 RT-qPCR 中,Maxima H Minus 反转录酶还可以对宽范围的模板起始量进行高效 cDNA 合成,提供灵敏、准确的 cDNA 定量。 高热稳定性Maxima H Minus 反转录酶相比其它同类反转录酶,可在较宽的温度范围内获得高产量的全长 cDNA (图 1)。其高反应温度耐受性可实现对具有复杂二级结构 RNA 模板的高效反转录,并有助于增强引物结合特异性,提高总产量。 图 1.在较宽的温度范围内获得高产量 cDNA。根据推荐的 实验方案,在一定温度范围内(42 °C、50 °C、55 °C、60 °C、65 °C),使用 1 μg Invitrogen Millennium RNA markers (poly(A)-tailed)、Oligo(dT)18 引物和 (A) Maxima H Minus 反转录酶(20U)进行 cDNA 合成。 同时按照各个供应商推荐的实验方案,对其它供应商的反转录酶进行类似反应,包括 (B) Takara PrimeScript RT、 (C) Promega GoScript RT 和 (D) NEB ProtoScript II RT。反应产物通过碱性凝胶电泳进行分离。高持续合成能力借助独有突变,Maxima H Minus 反转录酶与野生型 MMuLV 反转录酶相比,其持续合成能力提高了 50 倍。该反转录酶可针对多种类型 RNA 模板进行全长 cDNA 合成 (图 2)。 图 2. 两步法 RT-PCR 中的靶标扩增(达 20 kb)。按照供应商推荐的实验方案,使用Maxima H Minus 反转录酶对源于人类细胞(泳道 1 和 2)或小鼠细胞(泳道 3 和 4)的总 RNA(1 μg)进行反转录。得到的 cDNA 产物用作 PCR 的模板。M:Thermo Scientific GeneRuler 1 kb Plus DNA Ladder。高效 cDNA 合成Maxima H Minus 反转录酶可对宽范围的模板起始量进行高效 cDNA 合成,在 cDNA 产量和线性度方面均优于其它供应商的 RT 产品,是 RT-qPCR 实验的理想选择 (图 3)。Thermo Scientific Maxima 第一链 cDNA 合成试剂盒中的预混液有助于进一步提高实验可重复性,同时节省反应体系配制时间。 图 3.对宽范围的 RNA 起始量进行高效反转录。 相比其它供应商的反转录试剂盒,Maxima H Minus 第一链 cDNA 合成试剂盒始终可提供更高的反转录效率。扩增曲线显示了 log(ΔRn)随 PCR 循环数的变化。使用 HeLa 细胞总 RNA (1 μg-1 pg)的 10 倍连续稀释液对人 β-2 巨球蛋白基因进行 RT-qPCR 分析。使用 Maxima H Minus 第一链 cDNA 合成试剂盒和其它 7 种商业化第一链 cDNA 合成试剂盒进行第一链 cDNA 合成。 使用 TaqMan Universal Master Mix II, with UNG 在 Applied Biosystems ViiA7 实时荧光定量 PCR 系统上扩增 cDNA。 |
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