靶向CD30抗体偶联药物的制备及其抗淋巴瘤活性研究

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作者：

王蓉

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摘要：

第一部分抗CD30抗体与力达霉素偶联药物的制备和抗淋巴瘤活性研究研究目的:抗体偶联药物(antibody-drug conjugates,ADC)的发展和临床应用改变了血液恶性肿瘤的治疗模式.CD30是肿瘤坏死因子受体超家族(tumor necrosis factor receptor superfamily,TNFRS)成员,属于I型跨膜糖蛋白,其特异性地高表达于霍奇金淋巴瘤(Hodgkin lymphomas,HLs)和间变性大细胞淋巴瘤(anaplastic large cell lymphomas,ALCLs),可作为抗体偶联药物的理想靶点.力达霉素(lidamycin,LDM)是我所自主研发的烯二炔类高效抗肿瘤抗生素,由活性烯二炔发色团AE和辅基蛋白LDP组成,二者可在体外进行拆分和组装,LDP可通过基因工程技术与抗体偶联.因此,LDM是理想的ADC"弹头"药物.本研究以LDM为"弹头"药物,通过基因工程和体外组装相结合的"两步法"构建靶向CD30的新型ADC,并研究其对HLs和ALCLs的抗肿瘤活性.研究方法:通过基因工程技术将LDP偶联到抗CD30抗体的轻链N端,构建融合蛋白anti-CD30-LDP,并采用CHO表达系统获得目的蛋白.通过ELISA,Biacore,流式细胞术等方法验证融合蛋白与重组CD30抗原及CD30+肿瘤细胞的亲和活性,通过免疫荧光共聚焦检测其能否通过抗原介导的内吞作用进入细胞,并通过活体成像技术监测其在荷瘤小鼠体内的靶向性.在此基础上,将活性发色团AE与anti-CD30-LDP进行组装,获得ADC药物anti-CD30-LDM,通过CCK-8,流式细胞术,Western Blot等实验检测其体外细胞杀伤活性和诱导凋亡的机制,并通过小鼠体内实验检测其对Karpas299移植瘤模型的抗肿瘤效果.研究结果:本研究应用CHO细胞表达体系,从大量单克隆细胞中筛选获得高表达目的蛋白的细胞株.经细胞扩大培养和Protein G亲和层析柱分离纯化,得到融合蛋白anti-CD30-LDP,HPLC检测蛋白的纯度大于98%.ELISA,流式细胞术实验表明融合蛋白与重组CD30抗原及CD30+肿瘤细胞都具有很强的亲和性和特异性;通过Biacore实验计算其与重组CD30抗原的平衡解离常数为2.08 nmol/L,免疫荧光共聚焦实验表明融合蛋白能通过抗原介导的内吞进入细胞并被转运至溶酶体.小动物活体成像也表明融合蛋白在荷瘤小鼠体内具有很好的肿瘤靶向性,并延长了LDP在肿瘤部位的滞留时间.组装发色团AE后,anti-CD30-LDM对CD30+细胞具有很强的增殖抑制和杀伤活性,IC50值(半数抑制浓度,half-maximal inhibitory concentration)在0.005～0.05 nmol/L之间,并将细胞周期阻滞在G2/M期进而促进细胞凋亡.动物实验结果显示,anti-CD30-LDM给药剂量为0.7mg/kg时抑瘤率为87.76%,并且无明显毒副作用.研究结论:本研究通过"两步法"制备了新型ADC anti-CD30-LDM,体内外实验结果表明其具有较强的抗原亲和性,肿瘤靶向性和抗肿瘤疗效,可作为一种新型的有发展前景的治疗CD30+淋巴瘤的候选药物.第二部分Anti-CD30-LDM联合克唑替尼对间变性大细胞淋巴瘤的治疗作用研究目的:对于复发性和难治性间变性大细胞淋巴瘤(anaplastic large cell lymphomas,ALCLs)的治疗是临床研究中的难点,选择有效的治疗靶点和治疗模式仍是治疗此类肿瘤的重要目标.在第一部分中,我们构建了一个新型的ADC药物anti-CD30-LDM,其对CD30+ALCL细胞具有很好的靶向性和杀伤活性,对NOD/SCID小鼠移植瘤具有显著的抑瘤效果.目前,联合用药是肿瘤药物治疗的主要形式和发展方向,并且有研究表明ADCs与小分子靶向药物的联合可以显著增强单药的抗肿瘤效果.因此,为进一步提高anti-CD30-LDM的抗肿瘤效果同时降低给药剂量,我们考虑其与小分子靶向药物联合在ALCL肿瘤细胞中能否取得更好的效果.在对ALCLs的研究中,发现有60%以上的CD30+ALCL患者表达NPM-ALK融合蛋白,NPM-ALK通过激活MEK-ERK途径,JAK-STAT3途径以及PI3K/Akt通路促进细胞增殖,从而进一步促进肿瘤的发展和转移.克唑替尼是ALK的小分子抑制剂,被批准用于治疗EML4-ALK融合蛋白阳性的晚期或转移的非小细胞肺癌(non-small cell lung cancers,NSCLCs).临床研究表明,克唑替尼对 NPM-ALK融合蛋白阳性的ALCLs具有很好的抗肿瘤效果和安全性.基于以上分析,本课题尝试研究anti-CD30-LDM与克唑替尼联合作用对CD30+ALK+ALCL细胞的抗肿瘤效果,并探索二者联合的作用机制,以期提供具有临床应用潜力的ALCLs治疗策略.研究方法:选择CD30+ALK+的ALCL细胞系Karpas299和SU-DHL-1研究anti-CD30-LDM与crizotinib的联合作用.通过CCK-8实验检测两药联合作用对肿瘤细胞的增殖抑制作用;通过Annexin V-FITC/PI染色结合流式细胞仪分析两药联合对细胞凋亡的影响;通过caspase-3/7活性检测试剂盒检测两药联合对caspase-3/7的诱导作用;通过Western Blot检测两药单独或联合作用后细胞相关蛋白的变化,并探讨其联合作用机制;建立Karpas299和SU-DHL-1细胞小鼠移植瘤模型,评价anti-CD30-LDM与crizotinib联合作用的体内抗肿瘤效果.研究结果:CCK8实验结果显示,anti-CD30-LDM和crizotinib联合作用于ALK阳性的Karpas299和SU-DHL-1细胞时具有明显的协同增殖抑制作用(CDI1),而对ALK阴性的L428细胞无协同抑制作用;Annexin V-FITC/PI和流式细胞术分析表明两药联合作用细胞凋亡率明显高于单药组;通过对细胞caspas-3/7的活性检测证明,两药联合后caspase-3/7的活化水平可达对照组的6～8倍,分别是单药组的2.5倍以上;Western Blot结果也表明两药联合增加了 caspase-3和caspase-7的活化水平,并使PARP失活从而诱导细胞的凋亡;通过对其作用相关信号通路研究表明,低剂量的anti-CD30-LDM可诱导肿瘤细胞DNA损伤,使p53蛋白磷酸化,调控DNA修复并诱导细胞凋亡,但同时激活了促细胞增殖的ERK1/2信号通路,而crizotinib通过抑制NPM-ALK的磷酸化水平,进而抑制其下游ERK1/2的磷酸化,使得活化的ERK1/2通路被封闭,从而增强了 anti-CD30-LDM诱导的细胞凋亡作用;anti-CD30-LDM和crizotinib联合作用能够显著抑制Karpas299和SU-DHL-1小鼠移植瘤的生长.研究结论:本研究首次发现并证明了 ADC药物anti-CD30-LDM与小分子靶向抑制剂crizotinib的联合在肿瘤治疗中具有协同作用,其作用机制为crizotinib通过抑制ERK1/2信号通路的激活增强anti-CD30-LDM对ALCL细胞的增殖抑制和凋亡诱导作用.该联合策略对DNA损伤类细胞毒性药物或ADCs的临床应用具有重要的指导意义.

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关键词：

CD30；抗体偶联药物；力达霉素；淋巴瘤；肿瘤靶向治疗；Anti-CD30-LDM；克唑替尼；间变性淋巴瘤激酶；间变性大细胞淋巴瘤；ERK1/2；DNA损伤

学位级别：

博士

DOI：

CNKI:CDMD:1.1019.009321