液相色谱缓冲液选择指南（HPLC和LC/MS ）

适用于HPLC和LC/MS的缓冲液

如果样品中含有离子化化合物，对于反相HPLC（RP-HPLC）分离，流动相pH值可作为控制保留的最重要的变量之一。

然而，如果控制不当，pH值也可能诱发诸多问题。

由于经RP-HPLC分析的大多数化合物含有一个或多个酸性或碱性官能团，因此大多数流动相需要控制pH值。

基于此，缓冲液的使用非常广泛。本手册为实际操作的色谱分析人员重点介绍了流动相pH值的一些重要方面。

图1表明，如果存在离子化化合物，则需要控制pH值。

如果酸性溶剂pKa上下浮动超过2个pH单位，则至少99％的部分将分别离子化或非离子化。

低于其pKa时，碱基将被离子化；而超过其pKa时，将被非离子化。

非离子化形式将具有较小的极性（更疏水），因此在反相体系中能够更加有效地保留下来。

所以，pH值较低时，会保留更多的酸性（图1a），而在高pH值下，会保留更多的碱性（图1b）。

如果流动相pH值接近pKa值，那么即便pH的变化极为微小，也会导致保留情况的巨大变化，因此，这不适合稳定分离。

图2a说明了部分化合物对pH的微小变化极为敏感。0.1个pH单位的变化就会导致分辨率两倍的变化，这是许多实验室常见的pH调节误差量。

图2b显示了酸性、碱性和中性化合物pH值与保留情况的关系。

pH为3时，其保留情况比pH为5时更加敏感（对于酸性），而对于碱性，则pH需要大于等于6。而且，当pH接近pKa时，保留时间将不稳定；如果存在类似结构的化合物，相应的峰值间距（选择性）会发生改变。

图2 流动相pH值的微小变化对分离的影响。

（a）碱性分析物：对氨基苯甲醚、间甲苯胺、对氯苯胺、间氨基苯甲腈（按保留次序）；27:73甲醇/磷酸盐缓冲液。（b）酸性（酸）：水杨酸；碱；甲基苯丙胺；中性；非那西丁。

在选择流动相pH时还应考虑的另一个因素是色谱柱的稳定性。

一般来说，硅基色谱柱应在27，因此如果在pH太高的情况下抑制电离会有害于大多数的色谱柱。

所以，在其它条件相同的情况下，最好是从较低的pH值开始。

如果您需要在高pH值下操作色谱柱，请确保所选色谱柱在您操作的pH区域内可以保持稳定。

如果低pH电离抑制无法提供可接受的结果，则可以调节流动相pH，以获得理想的分离效果。然而最具成效的是：调整流动相的有机物含量（％B溶剂），从而获得中性和非离子化合物可接受的保留时间；然后调整pH，进而微调离子分析物的保留时间。

由于离子化化合物的保留对流动相pH非常敏感，因此需要添加缓冲液来控制流动相的pH值。当添加少量酸或碱时，缓冲液会保持pH值。HPLC缓冲液中使用了许多不同的物质；部分添加剂会在表1中列出。

在pKa值上下浮动1个pH单位内使用时，缓冲液是最有效的；在pKa值上下浮动2个pH单位时，也可提供足够的缓冲。

表1. 常见的流动相添加剂1的pKa值

1 [1]的数据；2 默克索引；3 CRC物理化学手册

HPLC紫外检测最常用的缓冲液是磷酸盐和醋酸盐。

磷酸盐和醋酸盐是非常有用的缓冲液，因为它们可以在低于220nm的波长下使用。

从表2可以看出，磷酸盐具有三个pKa值，可提供如下三个缓冲范围：1.1