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免疫组化（IHC）指南
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本免疫组化（IHC）综合指南将带您了解从组织处理、抗体选择到检测、对照和疑难解析的全部内容。 In this comp目录 组织处理、固定和切片抗原修复阻断蛋白质阻断内源性酶一抗检测和扩增系统多色 IHC复染IHC 的对照品免疫组化（IHC）利用抗体检测组织切片中蛋白质和其他抗原的定位。抗体-抗原的相互作用通过有色酶底物显色检测或荧光染料荧光检测进行观察。 虽然 IHC 在定量方面不如蛋白质印迹或 ELISA，但是 IHC 可以提供完整组织中蛋白定位的宝贵信息。蛋白表达谱对病理学家以及作为诊断工具都具有重要意义。 IHC 实验成功的关键在于稳定、优化且可重复的染色方案，而该方案应使用优质的特异性试剂。 点击此处获取指南的 PDF 版本IHC 资源 试剂盒与试剂IHC 一抗IHC 二抗组织处理、固定和切片组织固定可保存抗原，防止收获的组织自溶和坏死。包埋组织可在切片过程中提供支持，使切片更耐用。 设计 IHC 研究的第一步是决定如何制备组织切片。最常见的方法是石蜡包埋。也可以选择冰冻切片和浮动切片——每种方法都有各自的优势和局限性（见表 1）。 样本固定是组织处理的关键步骤，也是阻止抗原、细胞和组织降解的关键。10% 的福尔马林缓冲溶液以及 4% 的甲醛（又称多聚甲醛）是典型的固定剂——两种溶液几乎相同；福尔马林是 40% 的甲醛溶液。 收集样本后，快速、彻底地固定或冷冻样本，并确保样本不会大到无法完全固定或快速冷冻，这一点至关重要。 表 1. IHC 石蜡切片 vs 冰冻切片 vs 浮动切片。 石蜡包埋组织 冰冻组织 浮动切片 固定 包埋前：甲醛 切片前或切片后：甲醛、甲醇、乙醇或丙酮 切片前：甲醛 包埋/冷冻 组织脱水、透明化处理后，加入石蜡（预热到 60°C），放置过夜。 将组织浸没在液氮、异戊烷中冷冻或将样本埋入干冰中冰冻。 检测磷酸化等翻译后修饰时，常使用速冻方式。 不需要包埋。 切片 薄片切片机 低温恒温器 振动切片机 储存 室温下储存多年。 -80°C 下可储存 1 年（-190°C 下储存时间更长）。 置于冷冻保护剂中 -20°C 下储存，或者 4°C 下在 PBS +叠氮化合物中短期储存。 优点 容易操作，不会损坏切片。 保留酶的功能和抗原性。 方案耗时较短（通常不需要冗长的固定步骤）。 可使用厚一点的切片（> 25 µm）：可以更好地分析组织的 3D 结构。 局限性 过度固定会掩盖表位 - 从而增加抗原修复需求。 长时间处理：例如在酒精类和二甲苯中逐渐脱水，以允许石蜡渗透。 如果组织没有快速冷冻，冰晶的形成可能会损坏组织结构。 冰冻切片通常比石蜡切片厚，可能会导致分辨率低、图像差。 可能需要阻断活性内源性酶。 较小结构和单个细胞的成像更难。 可能需要额外的组织透明化方法（如 CLARITY），以减少光散射并对较厚的切片进行成像。 回到顶部 抗原修复对甲醛固定的组织切片进行抗原修复，以暴露抗原位点，从而使抗体结合。 甲醛固定会导致蛋白质交联（亚甲基桥），从而掩盖抗原表位，而且可能会限制抗原-抗体的结合。抗原修复方法（见表 2）则会破坏这些亚甲基桥，暴露出抗原表位，允许其与抗体结合。 冷冻组织切片通常不够坚固，进行抗原修复时会损坏切片。人们一般会避免用甲醛固定剂固定冷冻切片（或者在使用时大大减少暴露时间），从而省去/减少抗原修复步骤的需求。 
用兔单克隆抗-ZO1 抗体 (ab221547)标记人肾脏组织进行免疫组化。使用 pH 9.0 的 Tris/EDTA 缓冲液 (ab93684)进行热介导的抗原修复。 表 2.抗原修复的主要方法。 热诱导抗原表位修复 蛋白水解物诱导抗原表位修复 优点 表位修复更温和且可确定参数更多。 适用于较难修复的抗原表位。 pH 通常使用 pH 6 的缓冲液，但 pH 高的缓冲液的适用范围也很广。必须通过实验确定最佳 pH 值。 pH 值通常为 7.4。 温度 约 95°C。 通常为 37°C。 孵育时间 10-20 分钟。 10-15 分钟。 缓冲液组分 取决于靶抗原所需的 pH 值。 常用的缓冲液包括柠檬酸钠、EDTA 和 Tris-EDTA。 酶的中性缓冲液，如胃蛋白酶、蛋白酶 K 或胰蛋白酶。 注意事项 微波加热可能会导致抗原修复不均。剧烈沸腾会导致组织与载玻片分离。 酶法修复有时会损坏切片的形态 - 浓度和时间需要优化。 抗原修复资源 抗原修复用缓冲液抗原修复实验方案回到顶部 阻断蛋白质用血清或蛋白封闭，防止非特异性抗体结合，并减少背景和潜在的假阳性结果。 使用血清或蛋白封闭液进行封闭对防止抗体与组织或 Fc 受体（与抗体恒定区（Fc）结合的受体）的非特异性结合至关重要。 与二抗种属匹配的血清是很好的封闭液。蛋白质，如牛血清白蛋白（BSA）或酪蛋白，可用于阻断非特异性抗体结合。 我们建议在使用基于亲和素/生物素的检测系统时，阻断内源性生物素，因为内源性生物素存在于许多组织中，尤其是肾、肝和大脑中。用亲和素孵育组织前，先阻断内源性生物素，然后用生物素孵育，以阻断抗生物素蛋白分子上的额外生物素结合位点。 如果使用与样本种属相同的一抗（例如，小鼠组织上的小鼠抗体），则应采用抗该种属的二抗的 F(ab) 片段进行封闭。F(ab) 片段结合并浸润组织切片中的任何内源性抗体，阻断二抗的结合。但是，这种 F(ab) 方法不能完全阻断，并且会留下一些背景。 蛋白封闭资源 用于封闭的正常血清用于封闭的缓冲液、试剂、试剂盒回到顶部 阻断内源性酶使用酶检测方法，需阻断内源性酶，以免混淆您的结果。使用一抗孵育后，需考虑阻断内源性酶，因为像 H2O2这样的处理会破坏抗原表位，影响结合。如果您的抗体是 HRP一抗偶联物，那么在加入一抗之前，需要先完成阻断处理。 显色检测法通常使用与二抗偶联的酶来显示抗体位置。如果组织样本中也有内源性酶活性，开始检测前必须阻断内源性酶，这一步至关重要。 过氧化物酶封闭使用辣根过氧化物酶（HRP）偶联抗体进行检测时，内源性过氧化物酶活性可能会导致非特异性或高背景染色。一抗孵育前，用 3,3'-二氨基联苯胺（DAB）底物孵育组织，检查内源性过氧化物酶活性。如果组织变成棕色，表明存在内源性过氧化物酶（比如通常在组织血管的红细胞中发现），需要进行阻断步骤。过氧化氢（H2O2）是最常用的过氧化物酶封闭剂。 碱性磷酸酶封闭使用内源性碱性磷酸酶（AP）偶联抗体进行检测时，AP 会产生高背景染色。用 5-溴-4-氯-3-吲哚基-磷酸盐/氯化硝基四氮唑蓝（BCIP/NBT）孵育组织后，可检测组织中的内源性 AP。如果观察到蓝色，表明存在内源性 AP，需要进行阻断。可用的碱性磷酸酶抑制剂包括盐酸左旋咪唑、盐酸噻咪唑等。 回到顶部 一抗设计 IHC 实验的关键在于一抗的选择，因为免疫染色的成功需要借助与靶抗原特异性结合的一抗。 直接检测与间接检测选择一抗之前，您需要考虑使用直接检测还是间接检测方法。检测抗体时，可以直接通过与一抗偶联的标记进行检测，也可以间接利用在与一抗不同的宿主物种、抗体类型和亚型中培养的标记二抗进行检测。 直接检测适用于研究高表达的抗原无需使用二抗进行额外的孵育步骤（因此消除了二抗的任何潜在的背景染色）增加了多色实验设计的灵活性间接检测适用于所有抗原信号可用多种方法进一步放大（将在以下章节讨论）需要额外的阻断步骤和对照品IHC 资源 石蜡切片、冷冻切片和自由浮动式切片的 IHC 染色方案选择一抗需要考虑的要点：一抗在什么种属中培养？一抗是否能与目的蛋白结合？是否曾证实一抗在您的应用中有效？ 抗体特异性 抗体特异性最确凿的证明是，在目的蛋白已被敲除的组织或细胞中缺乏染色。其他指标有 信噪比：抗体可能结合正确的蛋白质，但也会有一定的噪音，因此应拒绝信噪比低的抗体如果无法进行 KO 验证，并且您仅确定定位特异性，则信噪比尤其重要染色模式与目的蛋白在对照细胞或组织中的已知定位一致已知不表达该蛋白质的组织或细胞缺乏染色。免疫印迹中仅看到单一条带
野生型（上图）和敲除 HAP1 细胞（下图）中 Ki67 抗体敲除试验的 ICC 图像。绿色代表抗 - Ki67 [EPR3610] (ab92742)、山羊抗兔 IgG (Alexa Fluor® 488) (ab150081)，红色代表抗 α-微管蛋白 [DM1A] (Alexa Fluor® 594) (ab195889),蓝色代表 DAPI 标记的核 DNA。 IHC 中的既往使用 在蛋白质印迹实验中可识别其靶蛋白的抗体在 IHC 中不一定能识别抗原；抗原在 IHC 中很可能以天然（三级 3D）形式存在。优先考虑能够有效应用于 IHC 的抗体。 克隆性 抗体克隆性取决于抗体来自不同的 B 细胞（产生多克隆抗体）还是来自同一亲代克隆的相同 B 细胞（产生单克隆抗体）。这些抗体有各自的优点和局限性。 表 3.多克隆一抗与单克隆一抗的优点和局限性。 多克隆一抗 单克隆一抗 优点 信号可能更强，因为有多个抗体与靶蛋白结合。对抗原的微小变化（例如多态性、糖基化异质性或轻微变性）有更强的耐受性。在更广泛的 pH 值和缓冲液组分范围内更稳定。特异性检测抗原上的特定或确定表位，使其不太可能与其他蛋白进行交叉反应。均一性高（尤其是重组抗体）- 如果实验条件保持不变，单克隆抗体产生的结果可重复性更高。局限性 批次间差异较大。可能发生交叉反应并产生非特异性信号*。在探测抗原的特异性结构域方面不及单克隆抗体有效。单克隆抗体靶向的抗原表位可能无法在不同种属间共享，因此，单克隆抗体的灵活性有限。抗原经化学处理后表位减少，比多克隆抗体更易受损。对实验条件（即 pH 值和缓冲液组分）的变化敏感。*抗原/表位亲和纯化增强了多克隆抗体（作为群体）的特异性，特别是在抗原较短（如一个多肽）的情况下。 回到顶部 检测和扩增系统对于间接检测，二抗是成功显示一抗分布的关键。 与使用标记一抗的直接检测不同，使用二抗和相关检测系统能够扩增信号，因为不止一个二抗分子与单个一抗结合。 显色与荧光检测您可以选择显色法，使用酶标记的二抗（如 HRP、AP），也可以选择荧光法（免疫荧光），使用荧光染料标记的二抗（如 FITC、R-PE、Alexa-Fluor®）进行检测。 显色法生物素标记的二抗和链霉亲和素-HRP 能进一步扩增 ABC 方法中的信号。或者，您也可以使用现代 HRP-聚合物二抗。一些沉淀物具有光稳定性（HRP/DAB 具有很好的光稳定性，但 HRP/AEC 在阳光下会褪色），所以载玻片有可能储存多年。仅需要标准的明场显微镜。酶/显色剂沉淀物的沉积区域比来自荧光源的光子沉积区域更宽，这可能影响个人解读结果的能力。该过程通常耗时较长，因为它的孵育和封闭步骤比荧光方法要多 — 但是，情况并非总是如此，具体取决于您使用哪种扩增系统。由于酶的扩增作用，定量一般比较困难。荧光法可在不同波长下激发多个荧光团，同时显示多个抗原（多路复用）。图像质量更好，分辨率更高。用酪胺染料标记 HRP 抗体，可以将荧光染料沉积在抗体染色部位，从而将信号扩增。更适合于信号定量。对自体荧光敏感，特别是甲醛固定。更快的实验步骤。需要更昂贵的成像设备。随着时间推移，荧光基团的稳定性降低。
石蜡包埋小鼠小脑组织切片中 NeuN 的荧光 IHC 图像。绿色代表抗 - NeuN [EPR12763] (ab177487)、与 Alexa Fluor®488 (ab150097) 偶联的山羊抗兔 IgG，红色代表抗 - GFAP (ab4674)、与 Alexa Fluor®594 (ab150176) 偶联的山羊抗鸡 IgY。图片由英国伦敦国王学院的 Carl Hobbs 提供。 酶和显色剂显色检测中需要考虑的其他因素有酶和显色底物的选择。每种检测酶都有几种不同的显色剂（见表 4）。HRP-DAB 是最常用的显色剂组合。 显色剂的一个优点是，您可以将其与有机封固剂一起使用，有机封固剂的折射率往往更好，获得的图像更清晰。但是，水介质的使用速度更快，因为无需对切片进行脱水。 表 4.用于免疫组化的常用酶和底物/显色剂。 酶 显色剂/底物 颜色 封固剂 优点 缺点 HRP DAB 棕色 有机/水溶性 深色；永久 组织中内源性过氧化酶活性可能导致假阳性染色 DAB + 镍增强剂 黑色 有机/水溶性 深色；永久 AEC 红色 水溶性 深色；双重染色与蓝色形成鲜明对比 AP BCIP/NBT 蓝色/黑色 有机 深色 组织内源性 AP 活性可能导致假阳性 固红 红色 水溶性 永久性红色 红色 有机/水溶性 
使用我们的微聚合物 IHC 检测试剂盒中的抗 - GSDMD 抗体 [EPR20859] (ab219800)和 HRP - 聚合物偶联二抗对石蜡包埋的野生型 (A) 和 GSDMD KO 小鼠小肠 (B) 进行 IHC 染色。组织样本由 Feng Shao 博士, NIBS 友情提供。 检测和扩增资源 IHC 检测试剂盒IHC 二抗IHC 显色试剂盒回到顶部 多色 IHC使用多色免疫组化 (mIHC) 可在单个组织切片中对多种标记物进行免疫染色。 传统的显色 mIHC 要求使用来自不同种属或不同种型的单个抗体。之后需要使用特异性二抗，并且每种标志物使用不同的显色剂。但是，很难在载玻片上区分两种以上的显色剂，尤其是在显色剂可以互相叠加的时候。 荧光 mIHC 可以轻松应用三种或者更多的标志物。它可以与荧光染料偶联一抗搭配使用，但是由于它们具有额外扩增效果并且染料偶联一抗存在局限性，所以它更常与染料偶联二抗搭配使用。基于可用的荧光滤光片组，以及对不同种属一抗/非同种型一抗的需求，大多数荧光 mIHC 只能使用三种标志物（加一次复染）。 增加标志物数量的常用方法是：a）光谱分解显微镜，能够区分更多荧光染料；以及 b）顺序抗体剥离和染色方法，经常与酪酰胺信号扩增搭配使用。其他方法（如成像型质谱流式系统）取决于生成的伪图像。 mIHC 可以通过一个组织切片生成大量数据，从而有效减少所需的组织量，并且更好地理解不同标记物之间的关系。 
使用 IV 型胶原（黄色）、胰岛素（绿色）和胰高血糖素（红色）一抗以及 Cy2、Cy5 和 Texas red 偶联二抗对小鼠新生胰腺进行多色荧光 IHC 染色。图像由 Miller K et al. PLoS One 4(11): e7739 提供 多色 IHC 资源 mIHC 用 Alexa 荧光偶联二抗mIHC 染料偶联一抗回到顶部 复染对特定形态或结构进行复染，有助于一抗的定位。 进行 IHC 时，使用复染可以让您看到与组织内细胞结构存在关联的抗体染色位置。 与 HRP-DAB 的棕色形成对比，IHC 显色法最常用的复染剂是苏木精，它可以将细胞核染成蓝色。苏木精是“蓝色”的弱碱性溶液（大多数区域使用自来水即可，但是仍需进行确定）。 在荧光 IHC 中，最常用的复染剂是蓝色核染料 DAPI。 在这两种情况下，一定要选择一种与您的染色系统兼容并且不会干扰报告基因标签信号的复染剂。 表 5.常见复染剂及其靶标。 种类 染料 靶标 颜色 显色法 苏木精 细胞核 蓝色至紫色 显色法 核固红（Kernechtrot） 核酸 红色 显色法 甲基绿 核酸 绿色 荧光法 DRAQ5™ 核酸 红色 荧光法 DRAQ7™ 核酸 红色 荧光法 核黄 (Hoechst S769121) 核酸 黄色/蓝色 荧光法 核绿 DCS1 核酸 绿色 荧光法 Hoechst 染色 核酸 蓝色 荧光法 DAPI 核酸 蓝色 荧光法 碘化丙啶 核酸 红色 
福尔马林固定的石蜡包埋人肝切片被铁离子染色试剂盒 (ab150674)染色后的 IHC 图像。蓝色代表铁染色，粉色代表核固红染色。也可用于识别组织的特异性特征，有时也用于复染。 复染资源 免疫组化的复染及特殊染色回到顶部 IHC 的对照品您可通过运行适当的对照品来确认染色模式的有效性，并排除实验伪影。 您应纳入几种不同的阳性和阴性对照品，并保留详细的实验记录，以确保效能一致。 抗原（组织）对照品阳性对照品：已知表达目的蛋白的组织切片。阴性对照品：已知不表达靶抗原的组织切片。内源性组织背景对照：未使用一抗的组织切片。某些组织具有导致背景染色的固有特性，可能会影响结果分析。比如某些组织有内源性荧光分子，可能会与荧光 IHC 过程中的阳性染色混淆。应使用显微镜检查组织，确保没有内源性背景。 |
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