实验员小哈&Western blot关于Stripping（洗膜/膜再生）的一些心得

在我上传的Western blot操作系列视频中，Stripping（洗膜/膜再生）这一步，没有仔细讲，用了个成品洗膜液，一笔就带过去了。于是，就有很多同学跑来问。于是，我打算在这篇专栏里把这个坑填上。

为什么要做Stripping？因为想偷懒，想节省蛋白样本。能在一张膜上做完的抗体，就不想多跑第二张膜来做。除此之外，目标蛋白和内参蛋白在同一张膜上跑出来，可以排除加样和不同的胶之间的系统误差，比较具有样本间的可比性。

但是！不是所有情况下，Stripping以后得到的结果都是可靠的，同一张膜的Stripping次数也是有限的（3-4次顶多了）。因为每一次Stripping，都会洗掉一部分蛋白样本。所以，如果需要证明某个目标蛋白在样本中不表达或表达量极低，这一轮抗体染色就不应该放在Stripping之后做。

Western blot有多种类型的膜可以用，不是所有类型的膜都适合做Stripping。PVDF膜是最适合做Stripping的膜类型，蛋白样本的丢失量最小。

不同的显影剂，对Stripping的效果也有影响。有的类型的显影剂，染色是牢固而永久的，洗不掉。最容易洗掉、适合做Stripping的显影剂是ECL。

好，以上是Stripping的一些前提和注意事项。

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先来谈Stripping buffer的选用。

市面上买到的成品Stripping buffer，如果没有特别标明强力、强效、harsh等，打开来也没什么特别臭的味道，那么多半是一个比较温和的buffer。染色比较浓的条带，用这类buffer肯定是不能完全洗掉的。

强有力的Stripping buffer，多半含有ß-mercaptoethanol（ß-巯基乙醇，英文小名ß-me），这货特别特别臭，在通风厨外千万不能打开，只需要一滴，就可以臭到窒息。并且这货对抗体结合有非常强的破坏作用，痕量残余都会影响下一轮的抗体染色。所以洗完以后，膜要彻底冲洗，并用TBST加洗一次，确保ß-me零残留。

这里，向大家提供一个强力Stripping buffer的配方：

每100ml：

    20 mL SDS 10%     12.5 mL Tris HCl, pH 6.8, 0.5 M    67.5 mL distilled water    0.8 mL ß-mercaptoethanol

切记，一定一定要在通风厨里配！最好把摇床也搬进通风厨，洗膜也不要拿出来。

除了buffer本身的成分会影响洗膜效果，洗膜的时间、次数和温度也会。时间越久、次数越多、温度越高，洗脱的效果就越强。

这里，向大家介绍一组适中的、可以作为起始尝试的洗膜条件：

    温和buffer：先试试每次15分钟，洗三次，室温。（或遵照产品说明书）

    上述配制的强力buffer：先试试只洗一次，20分钟，室温。如果洗不掉，可以尝试升温（不超过45度）和延长洗膜时间（不超过45分钟）。

需要强调一点：强效的Stripping buffer，能把上一轮的染色条带洗得比较干净，但蛋白样本的损失量也会更多，下一轮染色失败的风险增大。

所以1，能用温和的buffer洗掉的，就不要用强力的。

所以2，同一张膜染多个抗体，先分别摸一下条件，看哪个抗体条带染得最浓、最不好洗，就把这个抗体放到最后一轮做。一般，内参蛋白的条带是最浓的。但是也有例外的情况，确实是有比内参还难洗掉的条带。

祝大家的Western blot都顺利！