【BEAVER Chat】为什么有些时候蛋白质纯化过程洗脱效率低？（附原因解析及解决方案）

图1：蛋白亲和纯化洗脱原理示意图

若发现流穿液中目标蛋白明显减少，但洗脱液中的目标蛋白很少，很大可能是由于蛋白洗脱不完全。

为进一步确认是否为蛋白洗脱不完全，可取少量洗脱后的磁珠，加入1×SDS Loading buffer，95℃加热5-10min，SDS-PAGE胶检测是否有目的蛋白条带。若有，则代表目的蛋白洗脱不完全（或几乎未洗脱下来）。 

原因1：洗脱条件太温和

解决方案：

1）提高洗脱液中的竞争洗脱成分（eg.增加咪唑浓度）

2）增加洗脱液中离子强度（例：NaCl浓度），以降低蛋白间相互作用

3）增加洗脱体积

4）延长洗脱时间

5）调整洗脱溶液的pH （eg. His可降低pH至4.0，GST可调整到8-9）

6）洗脱成分失效（eg.GST蛋白洗脱液需现用现配）

原因2：非特异性疏水吸附或沉积（尤其针对水溶性差的蛋白）

解决方案：

1）裂解、洗涤、洗脱液中添加0.5%-2%的Triton X-100或Tween-20

2）裂解、洗涤、洗脱液中添加1-2M尿素（蛋白不会变性）

3）以上两种方法都不能使蛋白洗脱，可加4-8 M 尿素，或4-6 M 盐酸胍使蛋白变性洗脱。

原因3：蛋白间形成聚集（针对具有丰富二硫键的蛋白）

解决方案：

缓冲液中加入1-2mM DTT或1-5mM巯基乙醇

注：针对有大量蛋白沉积的磁珠，需要用0.5M NaOH或4-8 M 尿素（或4-6 M 盐酸胍）清洗磁珠、再生。

实际案例：

利用BeaverBeads™ Magrose Strep-Tactin（Cat.#70808）纯化水溶性较差的Strep-tag II标签蛋白。初步实验，发现洗脱液中无目的蛋白。但洗脱前的磁珠和HABA再生后的磁珠，跑胶显示都有目的蛋白，此外，即使HABA再生也不能将目的蛋白从磁珠上洗脱下来，证明蛋白沉积在磁珠上。

图1：初步实验纯化效果。红框区域为目的蛋白区域，beads before elution:洗脱前的磁珠，beads after HABA:HABA再生后的磁珠，Elution:洗脱产物。

调整实验条件，将裂解、洗涤和洗脱液中分别添加1%的Triton X-100后，磁珠结合与洗脱效率都得到很大提升

图2：改进后各步骤的SDS-PAGE结果。红框为纯化后的目的蛋白区域。