知无不“研”

d)CoIP-MS风险：由于存在特异性抗体高丰度蛋白，质谱不一定能够鉴定到诱饵蛋白。

Co-IP技术案例分析

a) 两个已知蛋白互作验证（体内实验）

常规思路：通过一系列功能实验确定某个信号通路，明确通路相关蛋白并进行验证。

文献中：通过CoIP-WB验证诱饵蛋白CEBPB和互作蛋白PGC1α是否结合，进一步确定HCP5/miR-3619-5p/AMPK/PGC1α/CEBPB通路在胃癌中的作用。

From：MSC-inducedlncRNA HCP5drove fatty acid oxidation through miR-3619-5p/AMPK/PGC1α/CEBPB axis to promotestemness andchemo-resistance of gastric cancer.

b) 通过质谱筛选某个已知蛋白可能结合蛋白（体内实验）

常规思路：通过组学或其他手段确定某个功能相关蛋白，进一步筛选确定该蛋白作用机理，则可以选择CoIP-MS.

文献中：通过CoIP-MS实验筛选到差异蛋白vimentin，CoIP-WB和GSTpull-down等方法进一步确定P62与vimentin互作。

From：p62/SQSTM1interacts with vimentin toenhance breast cancer metastasis.

c) 通过质谱筛选某个已知蛋白可能结合蛋白（体内实验）

特点一：使用EGFP融合蛋白标签做IP实验。

特点二：则是通过两次平行CoIP-MS实验，除了筛选两次差异蛋白外，进一步将两次差异蛋白取交集缩小筛选范围，从中选择Ngb蛋白互作蛋白。

From：Connecting theDots in the Neuroglobin-ProteinInteraction Network of an Unstressed and Ferroptotic CellDeath NeuroblastomaModel.

Co-IP技术疑点分析

1、Co-IP可不可以用珠子做？比如HIs GST的琼脂糖？

答：Co-IP是通过磁珠与抗体形成的复合物进行富集，HIs GST的琼脂糖这些柱料不适用。

2、请问Co-Ip如何选择合适的Input对照和同型对照？有什么要求和原则吗？

答：Co-IP使用Input阳性对照即可，Input即实验使用的细胞裂解液。

3、互作验证一定要western吗？纯化的蛋白可见呢？

答：可见蛋白只能判断蛋白大小，还是需要WB确定就是目的蛋白。

4、Co-IP时，Input的带型不够亮，怎么解决？

答：可以瞬转过表达处理。

5、两个蛋白，哪个适合ip有要求吗？

答：有IP级别抗体的蛋白优先考虑作为诱饵蛋白。

6、请问Co-IP，INPUT的加样量是多少？那IgG和IP的上样量相应有要求吗？

答：通常上样量50ug/100ug。

7、免疫共沉淀如何避免假阳性？

答： Co-IP选择抗体尤为关键，特异性抗体可以排除非特异性结合进而排除假阳性。同时可以结合Co-IP反向验证进一步排除假阳性。若抗体浓度过高，则降低抗体浓度；若抗体特异性不好，则更换抗体。

8、质谱结果几百个怎么分析可能的互作蛋白？

答：如果蛋白较多，建议先做功能注释，从中选择与研究方向功能相关的蛋白；在这些蛋白通过质谱数据（得分）进一步排序，确认2-3个进行验证。

9、请问是不是在不知互作蛋白的情况下，用质谱或其他方法筛选；如果已知互作蛋白，直接用Co-IP？

答：已知蛋白互作验证CoIP-WB；未知蛋白互作筛选CoIP-MS。返回搜狐，查看更多