通过多物种细菌网络抑制尿路结石疾病可确保健康的草酸盐稳态

Miller AW, Choy D, Penniston KL, Lange D. Inhibition of urinary stone disease by a multi-species bacterial network ensures healthy oxalate homeostasis. Kidney Int. 2019 Jul;96(1):180-188. doi: 10.1016/j.kint.2019.02.012. Epub 2019 Feb 28. PMID: 31130222; PMCID: PMC6826259.

尿路结石的发病率正在迅速增加，草酸盐是所有肾结石中约 80% 的主要成分。尽管许多人从饮食中大量接触草酸盐及其潜在的肾毒性，但哺乳动物不会产生酶来代谢这种化合物，而是部分依赖肠道内的细菌来减少草酸盐的吸收和尿液排泄。虽然大量研究集中在草酸盐降解细菌的分离物种上，特别是那些对草酸盐有绝对需求的细菌，但最近的研究指出微生物群在草酸盐代谢和抑制尿路结石疾病方面具有更广泛的作用。在这里，我们检查了患有尿路结石病的患者和未患尿路结石的患者的肠道微生物群，以确定健康个体是否拥有更广泛的与草酸盐代谢相关的微生物网络。我们发现肠道菌群组成与尿路结石疾病之间存在性别特异性关联。健康个体中富含的细菌在很大程度上与那些与产甲酸草杆菌呈显着正相关的细菌重叠，产甲酸杆菌是一种被认为处于草酸盐代谢微生物网络中心的物种。此外，差异丰度分析确定了多个已知在啮齿动物模型中也会被草酸盐刺激的分类群。有趣的是，这些分类群的存在比 O. formigenes 的相对丰度或定植更能区分患者和健康个体。

高草酸尿症被定义为尿液中过量的草酸盐，通常 >45 mg/d，并且是草酸钙肾结石病的主要原因。1草酸盐作为正常新陈代谢的一部分在肝脏中内源性产生，并且在肠道中也会从含草酸盐的食物中吸收，2 – 7特别是当钙等膳食成分不受阻碍时，钙会在胃肠道中与草酸盐形成不溶性复合物道。在发现Oxalobacter formigenes之后，肠道细菌与草酸钙肾结石疾病之间存在直接联系。这种共生肠道细菌使用草酸盐作为其主要营养来源，因为它表达了一组专门的酶，能够快速降解高浓度的化合物并防止其吸收进入循环。8、9还提出了O. formigenes能够刺激草酸盐分泌从循环回到肠道的机制。10然而，许多研究调查了复发性肾结石形成者和非结石形成对照的定植状态，并表明没有O. formigenes单独不是结石病的原因，因为一些复发性结石形成者被定植，而一些非结石形成者则没有。事实上，研究报告称， O. formigenes对尿路结石病 (USD) 患者的定植率在 8% 至 100% 之间，而健康个体的定植率在 11% 至 100% 之间，一些研究报告没有显着差异。11 – 30此外，在报告这些结果的研究中，只有 55% 的研究表明O. formigenes的存在与尿草酸盐显着降低有关。最后，在最近一项涉及原发性高草酸尿症患者的临床试验中，O. formigenes尽管从粪便样本中大量回收了O. formigenes DNA ，但每天作为益生菌给药 8 周未能减少尿液草酸盐排泄。31这些结果表明，除了O. formigenes之外，细菌种类对于传达针对 USD 的保护可能很重要。

最近的研究已经超越了O. formigenes，并调查了有结石病史的患者与非结石形成对照患者肠道微生物群在属水平上的差异。26 ' 32 – 34在这些研究中一致，拟杆菌属在 USD 患者中丰富，而普雷沃氏菌属在健康个体中丰富。此外，在具有 24 小时尿液结果的患者中，真杆菌属的存在与尿液草酸盐呈负相关。32在 3 项研究中，健康组和 USD 组之间的草酸杆菌没有显着差异。然而，在一项研究中，当使用Oxalobacter 特异性引物，100% 的健康个体被O. formigenes定植，而 USD 患者只有 17%。14在同一项研究中，与消耗大量草酸盐的食草啮齿动物相似，根据 frc 基因的存在情况，患者被发现携带多种其他草酸盐降解细菌。26 , 35最后，最近一项进行鸟枪法宏基因组比较分析的研究发现，与对照组相比，患有 USD 的患者携带的草酸盐降解基因越来越少，尽管草酸杆菌没有显着差异。34尽管这些研/或抑制美元。

为了更好地了解对维持整体草酸盐稳态很重要的微生物网络，Miller等人。研究了Neotoma albigula（白喉林鼠）的肠道微生物组，这是一种食草哺乳动物，其前肠含有一种微生物组，即使在浓度为 12% 时也能高效降解膳食草酸盐。36木鼠微生物组的成分包括草酸杆菌、乳酸杆菌、梭菌和肠球菌，以及其他潜在的草酸盐降解细菌。35 – 39这些研究确定了肠道微生物组对增加膳食草酸盐的反应，这种反应刺激了一致的微生物核心群落，以草酸杆菌科为中心，这似乎对草酸盐降解至关重要。为了确定类似的草酸盐降解微生物组是否在维持非结石形成人群的整体草酸盐稳态中发挥作用，以及它们是否在一般结石病中发挥作用，我们检查了 USD 患者与同居健康患者肠道微生物组的差异控制，重点是与草酸杆菌相关的微生物网络，因为目前这是唯一与结石病相关的细菌种类。此外，与O. formigenes共生的物种（因此是Oxalobacter的一部分网络）但在草酸盐分解中没有直接作用可能在非草酸盐结石类型的形成中起作用。这不仅提供了草酸钙 USD 中草酸盐降解微生物网络的潜在作用，还提供了非草酸盐 USD 患者相关生态失调的潜在作用。

讨论

在本研究中，我们试图解决关于O. formigenes以外的肠道微生物组作用的重要知识空白和复发性美元中的其他草酸盐降解细菌。我们选择采用全球方法进行分析，而不是专注于特定的患者亚群，例如高草酸尿症患者，因为我们想确定患有 USD 的个体之间存在的潜在差异。在本研究中，我们将分析重点放在与草酸盐代谢相关的微生物网络上，因为迄今为止，这已被确定为与复发性肾结石病相关的唯一代谢途径。总的来说，我们假设健康人与 USD 患者相比会拥有更强大的与草酸盐代谢相关的微生物网络。以前的研究表明，草酸盐代谢与多种细菌群落有关，而不是与单一物种有关，36 , 37与O. formigenes相关的细菌网络分析是一种仅使用微生物群快照来识别代谢协作细菌的方法，这对临床研究很重要。

总体而言，我们发现与健康人群相比，所有 USD 患者的 Tenericutes 门显着减少（图 1a). 此外，在群落结构上存在性别特异性显着差异，但在患者和对照组的微生物群之间没有成员关系（图 1b和的和c),C)，这可能反映了结石风险中基于性别的差异。40当查看每个组内特定 OTU 的差异丰度时，我们发现 62 个 OTU 在患者中富集，而 103 个 OTU 在非结石形成对照组中富集。有趣的是，O. formigenes明显不存在于富含对照的 OTU 列表中，这表明其他细菌种类对于预防 USD 和/或草酸盐稳态更为重要。此外，我们发现与Oxalobacter相关的细菌的共现相互作用的数量比单独观察O. formigenes的存在或不存在更有效地将患者与健康对照区分开来。

为了确定在草酸盐稳态中具有重要性的细菌分类群，我们比较了富含健康个体并与Oxalobacter sp . 相关的细菌列表。（来自这项研究）以及 N. albigula 中受膳食草酸盐刺激的细菌种类列表。38这种草食性啮齿动物是研究微生物草酸盐代谢的理想选择，因为该物种数千年来一直在野外食用高草酸盐饮食，因此没有因为实验室饲养、剧烈的饮食变化或抗生素暴露而丢失任何细菌，实验室啮齿动物和人类的情况。35我们的比较揭示了两个要点。首先，一些分类群，例如Ruminococcus（来自 Ruminococcaceae 和 Lachnospiraceae 科）和Oscillospira，具有以下 OTU：(i) 始终存在于健康个体而非患者中，(ii) 与草酸杆菌的存在相关，以及 (iii) 在啮齿类动物中被草酸盐刺激. 这证实了之前的研究，这些研究检查了 USD 和健康人群之间微生物群组成的差异，26、33发现涉及瘤胃球菌和颤螺菌的OTU在对照中得到了丰富。斯特恩等。32没有进行这些观察，但报告了属水平的差异而不是 OTU 水平的差异。我们的比较揭示的第二点是一些类群，如拟杆菌、阿克曼氏菌、双歧杆菌、粪球菌和气味杆菌，在所有比较组中都刺激了 OTU，这一发现在很大程度上与 Suryavanshi 和 Stern 研究一致。26、32因此，我们的数据提供了初步证据，表明先前与啮齿类动物中的草酸盐代谢相关的分类单元也对人类具有针对 USD 的保护作用。更重要的是，我们发现患者和对照肠道微生物群之间不同的 OTU 包括分类群，例如Desulfovibrio和Methanobrevibacter，参与硫酸盐还原、甲烷生成和乙酸生成。这些细菌物种可能与O. formigenes密切相关，因为产甲烷菌、产乙酸菌和硫酸盐还原菌使用甲酸盐，甲酸盐是 O. formigenes代谢草酸盐的主要副产品，这就是我们认为它们共同关联的原因。41、42同样，产乙酸菌使用草酸盐分解的另一种主要副产物CO 2来产生乙酸盐，这是一种对宿主和其他微生物有益的营养物质。43事实上，O. formigenes不表达同化甲酸盐或 CO 2所必需的酶增加了它必须依赖其他细菌物种来实现这些功能的可能性。如前所述，这强调了除直接参与草酸盐分解的细菌以外的细菌在体内草酸盐代谢中发挥重要作用的可能性。37这一观察结果可以进一步解释为什么单独使用O. formigenes重新定殖只会产生短暂的结果。23未来的微生物学研究旨在了解草酸盐微生物组成员之间在功能水平上的精细相互作用，将更好地了解每个成员的作用及其在维持整体非结石形成环境中的重要性。

一个有趣的发现是，草酸盐降解微生物网络的紊乱也存在于非草酸盐结石患者中。总的来说，这项研究中至少有 5 名患者的结石不是基于草酸钙，但他们的微生物组显示出生态失调，其中包括草酸盐降解微生物网络的成员。尽管样本数量可能很少，但数据确实表明肠道微生物组的紊乱，包括与此处确定的草酸盐降解微生物网络相关的成员，可能会增加形成其他结石类型的风险，并需要在更大规模的研究中进行进一步调查。

病例和对照组之间没有饮食差异表明观察到的肠道微生物群差异与结石和/或其他因素的病理生理学有关，与饮食无关。尽管加拿大版美国国立卫生研究院饮食史问卷 (C-DHQ-I) 结果的营养分析不包括草酸盐（由于营养分析软件的局限性），草酸盐摄入量的替代指标，包括全谷物，蔬菜（包括作为单独类别的深绿色多叶蔬菜）、土豆、坚果和种子以及大豆，没有显示出差异。此外，影响饮食草酸盐从胃肠道吸收的饮食因素（例如，钙和镁）在各组之间没有差异，

众所周知，肠道微生物组在维持整体健康方面发挥着重要作用，其生态失调与包括 USD 在内的多种疾病状态有关。特别是对于草酸钙 USD，感兴趣的主要物种是O. formigenes，尽管其他兼性草酸盐降解物种也是研究的主题。8 , 13 , 23 , 31 , 44 – 50几个因素表明，尽管O. formigenes和其他草酸盐降解细菌确实与肠道中的草酸盐代谢有关，但它们并非单独负责该功能，也不足以抑制草酸钙 USD。首先，虽然发现大多数患者没有被这种严格的草酸盐降解细菌定植，但非结石形成个体也是如此。此外，许多草酸钙 USD 患者被O. formigenes 定植。51其次，尽管含有O. formigenes 的益生菌或兼性草酸盐降解细菌的混合物确实会减少尿液中草酸盐的排泄，但它们的作用（如果有的话）通常是短暂的。13 , 23分钟31分钟44分钟47 分钟– 50 ' 52相比之下，如果从N. albigula（其胃肠道具有高效细菌草酸盐降解网络的哺乳动物）进行全粪便移植，Sprague-Dawley 大鼠的尿草酸盐表现出显着且持续的减少。37 , 38第三，肠道微生物群是一个高度共生的环境，由复杂且完整的功能性微生物网络组成。53 , 54

总之，我们的结果表明，胃肠道中健康的草酸盐稳态可能不仅仅归因于O. formigenes的作用，而是可能涉及许多细菌物种之间的协同作用，包括Ruminococcus和Oscillospira。这肯定与肠道微生物组的高度共生环境一致，一个例子是我们的产甲烷菌样本与O. formigenes 的共定殖。此外，我们的数据表明，丢失的草酸盐微生物组成员可能会增加形成非草酸盐结石的风险，这与肠道微生物组的高度共生性质一致，需要进一步研究。尽管本研究的结果基于肠道微生物群的单一快照，但它们为更广泛地研究草酸盐降解微生物网络和 USD 的作用提供了强大的动力。

健康人群和尿路结石病 (USD) 人群之间整个肠道微生物群的特征。

( a ) 微生物群的门级概况。统计分析（t检验）显示 USD 患者的 Tenericutes 门显着减少（P = 0.012）。( b ) 基于未加权的 UniFrac 分析，微生物群落成员的 Beta 多样性。圆圈代表每个组比较的质心周围分散的多元均匀性。( c ) 基于加权 UniFrac 分析的微生物群落结构的 Beta 多样性。圆圈代表每个组比较的质心周围分散的多元均匀性。双向排列多变量方差分析揭示了加权的显着性别*美元状态响应（c) 但不是未加权 ( b ) UniFrac 分析（加权 UniFrac - 美元状态：P = 0.071；性别：P = 0.221；性别*美元状态：P = 0.018；未加权 UniFrac - 美元状态：P = 0.181；性别：P = 0.335 ；性别*美元地位：P = 0.589）。NF，无女性；NM，无男性；PCoA，主坐标分析；YF，是女性；YM，是的男性。