核酸定量内标与外标，你知道多少？

核酸定量内标与外标，你知道多少？

2020-6-30| 

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众所周知，在实时荧光定量

PCR

（

Quantitative Real-time PCR

）中模板的浓度对数值与

结果

Ct

值呈线性关系，

Ct

值越⼩，浓度越⾼。根据所选取定量数学模型的差别，主要有外标定

量法（外标法）和内标定量法（内标法）两种

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众所周知，在实时荧光定量

PCR

（

Quantitative Real-time PCR

）中模板的浓度对数

值与结果

Ct

值呈线性关系，

Ct

值越⼩，浓度越⾼。根据所选取定量数学模型的差别，

主要有外标定量法（外标法）和内标定量法（内标法）两种定量⽅法。这些数学模型就

像特殊标记的尺⼦，把得到的

Ct

值测量为浓度值。

外标法：即绝对定量，是使⽤⼀系列稀释的已知浓度标准品与临床标本同时进⾏测定，求出标准

品的

Ct

值与起始模板浓度之间的线性⽐例关系。通过待测标本的

Ct

值就可以在线性关系中求出其

原始的模板浓度。

内标法：是指将标准内标与待测样本在同⼀管内扩增，然后通过内标的量来推导待测模板的量，

是⼀种相对定量的数学模型。该模型是假定了临床样本和内标有⼀致的扩增效率。

[1]

A

内标法需要检测标准品吗？

需要。要实现对样本的定量检测，必然需要使⽤到已知浓度的标准品，就像天平称量离不开砝码

⼀样。内标法就像是⽤了⼀个苹果充当砝码，但这个苹果最初肯定得使⽤砝码称量⼀遍。

与外标法直接⽐较待测样本和标准品不⼀样，内标法使⽤靶基因

Ct

值和内标

Ct

值的差值进⾏运

算。多⼀个维度的参数，使得该⽅法更为准确，但也使得运算更为复杂。该差值与靶基因起始模

板量之间呈⼆次函数关系，所以需要测定更多的标准品（

6

个以上）才能保证这个⼆次函数的准确

性。

因此，内标法不但需要检测标准品，⽽且还需要检测更多的标准品。

A

如何不带标准品使⽤内标法？

不带标准品的内标法

=

调⽤标准曲线的外标法；由于成本的考虑，使⽤内标法的⼚家⼤都未使⽤

标准品。所以在检测过程中，这些⼚家便采⽤调取出⼚标准曲线函数的⽅式。部分实验室在使⽤

外标法时也会⽤到这个⽅法，但这种⽅式往往是极不被推荐的。因为如果不能排除不同仪器、不

同批试剂、不同实验环境（温度湿度）、不同实验操作等因素造成的影响，那么结果的准确性就

很难得到保证。

因⽽，⽆论是内标法还是外标法，如希望不带标准品进⾏检测，应尽量避免上述风险，所以只能

选择全封闭系统，并对使⽤环境做较为严苛的要求。