生物制品表征之分子量分析方法

生物制品是指利用生物体（如微生物、寄生虫等）、生物组织或动物毒素等成分，综合运用生物学、生物化学等学科的原理与方法制得的具有疾病治疗效用的生物活性制剂。生物制品可能由糖、蛋白质或核酸组成，或者这些物质的复杂组合，也可能是如细胞和组织这样的活体实体，主要包括疫苗、血液及血液成分、抗原、单克隆抗体以及重组治疗性蛋白等制品。分子量是蛋白质主要特征参数之一，是确定一种蛋白、进行蛋白质后续研究活动的重要前提。因此准确有效地对蛋白质分子量进行测定十分重要。

百泰派克生物科技BTP提供基于凝胶电泳法、MALDI-TOF测分子量、LC-MS测分子量、SEC分子量分布等方法的分子量分析服务。

一、凝胶电泳法分子量分析

1. 原理:

SDS-PAGE凝胶电泳是一种基于电泳分离的技术，在这种技术中，SDS（十二烷基硫酸钠）被用作蛋白质分子的表面活性剂，以便将蛋白质分子的电荷中和，从而使它们按照大小分离。

2. 实验仪器:

电泳仪

3. 应用:

可以根据标准品的分子量与迁移率做标曲，对目的蛋白的分子量进行计算（10-200kDa），还可以根据条带的深浅用软件进行纯度的计算。优势是耗时短、成本低。

4. 案例示意：

二、 MALDI TOF法分子量分析

1. 原理:

MALDI-TOF（基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱）一种软电离生物质谱,电离过程中将质子转移到生物分子或从生物分子得到质子,而使生物分子电离,离子在电场作用下加速飞过飞行管道,根据到达检测器的飞行时间不同而被检测即测定离子的质荷比（M/Z）与离子的飞行时间成正比，由于得到离子带单电荷，不需要通过计算即可得到分子量结果。

2. 实验仪器:

microflex™ MALDI-TOF（Bruker）

3. 应用:

适用于混合物及生物大分子的测定，有快速、准确、灵敏度高、质量范围宽等优势；不适用于高分辨质谱的含复杂糖基化、PEG修饰等样品可以用MALDI-TOF检测。

4. 案例示意:

图中横坐标为分子量，纵坐标为信号强度

三、 LC-MS分子量分析

1. 原理:

样品溶液在电场的作用下形成带高度电荷的雾状小液滴，在向质量分析器移动的过程中，经过电离，最后得到带单电荷或多电荷的离子。得到的不同电荷离子经过去卷积计算得到最终的蛋白质分子量。

左图为样品进质谱过程，右图为带不同电荷的质谱图

2. 实验仪器:

• 高效液相色谱仪：Ultimate 3000（Thermo Fisher Scientific）

• 电喷雾-四极杆飞行时间质谱仪质谱仪：AB SCIEX TripleTOF 5600（AB SCIEX）

3. 应用:

高分辨率质谱可以对蛋白质样品进行精确分子量测定（10-250 kDa），精度达到1Da，可分析蛋白质的修饰状态（比如磷酸化、小分子药物结合等），并对这些修饰情况进行相对定量分析；还可以对抗体的原始、还原、切糖分子量进行检测，以及抗体药物偶联的检测。优势是高灵敏度、高分辨率、高准确度。

4. 案例示意:

如图为去卷积后的分子量，横坐标为分子量，纵坐标为信号强度

四、 SEC分子量分布法

1. 原理：

SEC的分离机理是不同分子量大小的蛋白在通过多孔载体时所用时间不同，样品按分子尺寸由大到小的顺序依次流出。通过标准品的出峰时间和信号强度即可计算样品的分子量分布。

2. 实验仪器：

高效液相色谱（紫外检测器）：Waters 2695/2996

3. 应用：

可以对混合样品的分子量进行检测，适用于较为复杂的混合样品。

4. 案例示意：

如图横坐标为出峰时间，纵坐标为紫外信号值，表格为分子量分布

这四种方法有各自的优势和局限，比如想要快速得到样品的大致分子量和纯度，可以采用凝胶电泳法，想要得到较为准确的分子量，且样品量较低，可以使用LC-MS进行检测，如果目的蛋白含有较多的糖基化或PEG修饰，或者分子量在150kDa以上，可以使用MALDI-TOF进行检测，如果是较为复杂的混合样品，需要得到样品的大致分子量情况，可以用SEC分子量分布的方法进行检测。

常见问题"

问题1：高分辨质谱测定分子量的优势和局限分别是什么？

回答：优势：具有高灵敏度、分辨率和准确度，需要的样品量较少，可以检测蛋白质的精确分子量，可以分析较为复杂的混合样。局限：对于含大量糖基化和较多修饰的样品检测效果较差。

问题2：为什么用高分辨质谱只检测到单体分子量，没检测到非共价多聚体分子量？

回答：常规检测方法样品前处理过程和洗脱过程中会将非共价多聚体打成单体，检测非共价多聚体分子量需要使用native ms的方法进行检测。