Attune NxT流式细胞仪实验数据

Attune NxT流式细胞仪采用声波辅助流体动力学聚焦技术，可有效减少堵塞、分析各种细胞类型和样本，为您提供更多数据、更多细节和更大通量的使用体验。

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对于想避免荧光补偿操作的研究人员而言，该仪器配有4激光14种颜色，可使用常用染料组合，所需补偿很小或无需补偿。

补偿调节并不简单，需要各种阳性、阴性和染料颜色匹配的对照，同时还要仔细监测背景荧光 。 Attune NxT流式细胞仪配置多达4根空间立体排列的激光器，使您可以灵活选择染料和检测通道，其光谱可以达到良好分离，无较大重叠，所需补偿很小 (图1)。

图 1. 最佳实验设计——Attune NxT流式细胞仪采用免洗免裂解的方法，对人T细胞亚群进行6色免疫表型分析（且无需补偿）的实验方案。 用6种荧光探针染色人全血标本 (A) 设置CD45-Pacific Orange 结合物的荧光阈值，根据GlycophorinA-PE 阳性排除红细胞干扰事件。 (B)根据散射光特性对淋巴细胞设门，利用CD3表达区分 (C) T细胞。 (D, E)然后分析T细胞谱系标记物CD4和CD8及活化标记物CD62L的表达，区分初始/中枢记忆性T细胞(CD62L+)和效应记忆性T细胞(CD62L–)。 无需任何补偿，即可分析或显示数据。

Attune NxT流式细胞仪可配置多达4激光和14种颜色，能进行多参数分析(图 2)，且可兼容流式细胞仪术中最常用的荧光基团和荧光蛋白，与您目前的实验方案匹配。 采用可选配的561nm激光还可检测多种荧光蛋白(见图 3)。

图 2. 采用 Attune NxT流式细胞仪对小鼠调节性T细胞和树突细胞进行多参数（10色）分析。 在FSC/SSC点图中对淋巴细胞进行设门（A，左边）并且从后续的分析中去除表达B220的B细胞 (A，中)。 根据CD3的表达情况对B220-,CD45.2+门内的T细胞进行分析(A, 右)。 根据共同受体CD4或CD8的表达，将CD3+ T细胞分选成两个细胞亚群(B, 左)。 CD4+ T细胞内，有一个表达转录因子Foxp3和细胞表面标记CD25 (IL-2Rα)，并有抑制性调控作用的T细胞亚群 (B, 右)。 分离出来的CD3-细胞里有一个CD11c+MHCII+的稀有群体，是有抗原呈递作用的树突状细胞 (C, 左)。 脾树突状细胞可进一步细分为CD11b+和CD8+树突细胞亚群(C，右)，且都具有独特的抗原递呈特性。

Attune NxT流式细胞仪采用模块化设计，配有最常用的488nm激光器，可激发FP（EGFP）及其变体（emGFP，TurboGFP），并可升级为包括可选系列激光器—405nm，561nm和637 nm的激光器。 561nm激光器特别适合激发橙色和红色荧光蛋白变体：mCherry是一种具有高亮度和光稳定性的常用单体红荧光蛋白；mKate以其快速成熟的速度以及高pH稳定性和耐光性而闻名；mOrange2是明亮的单体的橙色-荧光蛋白。 405nm激光可用来激发像TagBFP或Azurite和T-Sapphire等其他荧光蛋白，TagBFP是一种明亮的蓝色荧光蛋白，是由TagRFP进行位点特定的和随机突变而来。 图3显示了使用Attune NxT 流式细胞仪检测TagBFP、emGFP、YFP、mOrange2、TagRFP、mKate和mCherry。

图 3. 使用Attune NxT流式细胞仪检测各种颜色的荧光蛋白。 通过构建质粒或病毒转染或转导的293FT 细胞或U2OS细胞表达不同的荧光蛋白。 使用405nm，488nm或561nm激光器，Attune NxT流式细胞仪以100μL/min的上样速度获取样品。 (A) 在VL1通道中使用440 / 50带通(BP)滤光片收集(A)蓝色荧光蛋白(TagBPF)荧光；在BL1通道中使用530/30BP滤光片收集(B) 翡翠绿GFP荧光(emGFP)和 (C) 黄色荧光蛋白(YFP，Venus变体)荧光(在细胞中用Premo™卤化物传感器转换)；在YL1通道中使用558 /16 BP滤光片收集(D) 橙色荧光蛋白(mOrange2)荧光和 (E) 红色荧光蛋白(TagRFP)荧光；在YL2通道中使用620/15 BP滤光片收集 (F) mKate荧光和(G)mCherry荧光。 每一个直方图叠图(灰色的峰)中显示出不表达荧光蛋白的对照组细胞。 TagBFP、mOrange2、TagRFP、YFP和mCherry由CMV启动子表达，emGFP和mKate由EF-1α启动子表达。 用BacMam 2.0转导系统将构建的YFP和RFP转导到U2OS细胞中，而用Lipofectamine3000试剂将构建的TagBFP，emGFP，mKate和mOrange2转导到293FT细胞中。 通过腺病毒转染系统将构建的mCherry转导到U2OS细胞中。

稀有细胞检测指对占总细胞比例小于1%的细胞群体的检测，包括干细胞，微小残留病细胞，自然杀伤细胞和新生儿溶血症细胞。 分析稀有细胞群体需要采集大量样本细胞才能获得准确、可靠的结果，这样导致其样本获取时间很长。 Attune NxT流式细胞仪可快速处理稀释样本，进样速率高达1mL/min。 常规的流式细胞仪采用传统的流体动力学聚集技术，最大进样速率仅为60–100 μL/ min，由于采集足够细胞进行分析需要很长时间，从而限制了稀有细胞群的检测。 Attune NxT流式细胞仪将声波聚焦与流体动力学聚焦相结合，进样速率达500 μLmin或1 mL/min，可以快速采集分析稀有细胞(图4 )。

图 4. 采集超过100 万个活细胞，检测其中占小鼠全部脾细胞0.2%的稀有树突状细胞亚群。 浆细胞样树突状细胞(pDC) 是一种特殊的细胞亚群，它们在病毒的刺激下产生大量I型干扰素，可根据免疫表型CD19–/B220high/CD317+进行鉴定。 用CD19-Pacific Blue 、CD317-Alexa Fluor 488 和CD45R/B220-PE流式抗体以及SYTOX AADvanced死细胞染料对小鼠脾细胞进行四色分析。 对SYTOX AADvanced染料阴性的活细胞进行设门，然后再选择CD19 阴性细胞进行设门。 进一步在CD45R/B220 和CD317 双参数散点图中分析pDC的比例。 采用500μl/min的上样速率，获取1.3x106个总细胞，细胞浓度为7.5 x 107 个细胞/ml。 B220+/ CD317+(右上象限)的pDC占CD19– 活细胞的比例为0.851% ，占全部脾细胞的0.194%。

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Attune NxT流式细胞仪采用声波辅助流体动力学聚焦，上样速度为12.5 μL/min–1 mL/min——速度比传统流式细胞仪快10倍，数据采集速率高达到35,000个细胞/秒。 意味着您可比以往更快、更准确地分析所有样品（包括低浓度和珍贵样品），且数据质量没有任何损失 (图5)。

图 5. 与3个竞争对手的仪器相比而言，Attune NxT流式细胞仪处理样品所需时间更短，但数据精确度依然未受影响。 (顶部)按Attune NxT流式细胞仪的高流速（1,000μL/ min）和3个竞争对手仪器的最大速度上样，分别采集10,000，100,000，1,000,000和10,000,000个细胞所需的时间，进行计算和绘作图。 计算假定样品浓度为106个细胞/mL，上样速度为以下所列流速（来源于竞争对手市场材料）： 竞品A： 66 µL/min。 竞品B： 120 µL/min。 竞品C： 60 µL/min。 (底部)高进样度下数据差异最小。 Jurkat细胞固定后，用碘化丙啶染色，并用RNA 酶处理，制成浓度为 1 x 106个细胞/mL 的溶液，在Attune NxT流式细胞仪上进行分析。 不论何种进样速率，即使是在1,000 μL/ min的最高进样速率下，细胞的G0/G1 和 G2/M 峰的变异系数(CV) 都很稳定。

细胞周期分析是精确检测多个细胞亚群之间荧光强度差异的典型实验之一。 使用Attune NxT流式细胞仪，无论样品上样速度多大 (图6)，结果差异都极小。 无需因为保障灵敏度，而牺牲高通量。

图 6. 采用Attune NxT流式细胞仪，可在高上样速度下最大程度地减小数据差异。 Jurkat细胞用乙醇固定后，用碘化丙啶进行染色，然后用RNA酶处理，制成浓度为1 x 106个细胞/mL 的细胞悬液，以不同的上样速度在Attune NxT流式细胞仪上进行分析。 所有图上左侧的峰反映G0/G1期的细胞，右侧的峰反映 G2期的细胞。 不论上样速度如何，Attune NxT流式细胞仪上G0/G1 和G2/M峰的宽度以及变异系数(CV%) 都很稳定，即便是在1,000 μL/ min的最高上样速度下也是如此。

Attune NxT流式细胞仪可以在您需要时提供更高的灵敏度。 即便是在1,000 μL/ min的高上样速度下，系统也可以保证最高灵敏度。 仪器采用的声波聚焦技术，可提供精确聚焦，从而确保很小的变异系数，以更好区分暗淡弱荧光信号和背景荧光，减少数据差异，实现更好的信号分离 (图 7)。

图 7. 不同流速下的灵敏度检测。 在(A)高端的传统流式细胞仪和(B 和 C)Attune NxT流式细胞仪上，采用561 nm 激光和(A)610/20或 (B 和 C) 610/15带通滤光片，运行荧光微球(Spherotech彩虹微球，3.2 μm) 。 传统流式细胞仪是在最高的灵敏度设置下运行(~12.5 μL/ min)。 Attune NxT流式细胞仪采用了2种不同的上样速度运行： (B)12.5 μL/ min，与传统流式细胞仪相同，以及 (C500 μL/min，上样速度高40x。 即便是在最高流速下，Attune NxT流式细胞仪亦可提供相当或更佳的结果。

分离和检测全血中白细胞的标准方法不仅耗时，且在分析前涉及大量的样品处理操作。 这会可能导致样品损失和细胞的生理学改变。 Attune NxT流式细胞仪显著提高了样品采集速率度，从而可提供免洗/免裂解的实验方案，最大程度地避免了细胞损失，简化了全血免疫表型分型过程中的样本制备流程 (图 8)。 该特性尤其适用于那些浓度较低的样本，如脑脊液(CSF) 、干细胞和珍贵样品（如小鼠血液，骨髓和细针抽吸物），这些样本需要采集全部样本以保证获取足够目的细胞。 

图 8. 在Attune NxT流式细胞仪上，采用紫激光侧向角散射光鉴别人全血中的白细胞(A)使用传统蓝激光488nm前向角散射光(FSC)和侧向角散射光(SSC)不能在检测全血中的白细胞。 使用荧光标记的特异性抗体反向设门分析白细胞(粉红色)和红细胞(蓝色)证明了该问题。 (B)通过采用Attune NxT无洗涤无裂解滤光片试剂盒并结合紫色405nm SSC，增强了全血中从血红细胞中分辨白细胞的能力。 与(A) 和(B)中的FSC和SSC分析相反比，(C)利用抗血红细胞标记物糖蛋白A抗体和抗白细胞标记物CD45抗体的散射光并进行反向设门分析，在人全血中识别白细胞更简单容易。 (D) 通过在(C)中所描述的用糖蛋白A和CD45抗体标记并进行反向设门分析确认后，使用紫激光和蓝激光SSC可识别全血中的白细胞，并且在使用紫激光SSC时白细胞和红细胞表现出不同的散射光特性。 (E) 根据紫激光散射光特性对白细胞设门时，可以检测出人全血中的3群主要白细胞群(淋巴细胞、单核细胞和粒细胞)。