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染色质可及性和结构
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了解更多关于染色质的结构以及用于研究染色质可及性和相互作用的方法 染色质由组蛋白和 DNA 组成：147 个碱基对的 DNA 缠绕在 8 个核心组蛋白周围，形成基本的染色质单位，即核小体。 染色质的功能是高效地将 DNA 包装成适合进入细胞核的小体积，并保护 DNA 结构和序列。将 DNA 包装到染色质中可以确保有丝分裂和减数分裂，防止染色体断裂，并控制基因表达和 DNA 复制。查找有关染色质结构及染色质可及性和相互作用研究方法的更多信息。 下载完整表观遗传学指南 目录 染色质结构 DNA 可及性与核小体定位的研究方法 染色体构象技术染色质结构基因组被有效地包装到细胞核中。DNA 缠绕在组蛋白周围，形成核小体，核小体由 147 个碱基对的 DNA 和 8 个核心组蛋白组成。核小体像珠串一样串连在一起，并被包装成更高阶的染色质结构（图 1）。 
图 1：染色质结构。DNA 缠绕在核小体周围，形成染色质纤维，然后再形成染色体 紧密缠绕在核小体或更高阶异染色质中的 DNA 是无法与转录因子、转录机制和其他 DNA 结合蛋白相结合的，从而导致基因沉默。但同时， “接头” DNA 和打开的常染色质结构却易于结合，允许活跃的基因转录。 为了改变基因表达和细胞编程，染色质处于不断被重塑的动态中，例如在不同的发育阶段或响应特定的刺激时。大的基因组区域可能被沉默，可能被激活，或者核小体被打开，以便特定的基因和 DNA 序列与之结合。 对于染色质结构和核小体定位的探索揭示了与特定细胞进程和疾病状态相关的表观遗传程序和机制。 DNA 可及性与核小体定位的研究方法为了了解在不同的细胞生物进程中染色质的结构与其功能之间的关系，首要步骤是对于暴露在外的活 跃转录区域和异染色质中紧密结合区域的基因组的比较研究。想要诠释某一时刻的基因组架构，研究人员可以使用以下三种方法之一：DNaseq、MNase-seq 或 ATAC-seq。 DNase-seq 和 ATAC-seq 绘制 DNA 的暴露区域， MNase-seq 则绘制受核小体保护的区域。有一点很重要请记住，这些方法展示的是一个动态过程中的某一瞬间，通常是反应了数千个细胞的平均状态。 如果一个特定的区域呈现动态变化趋势，或者群体内细胞之间出现差异，那么不同方法得出的数据结构便会不一致。为了解决这些问题，一些单细胞分析方法正在开发中。 DNAse-seq DNase-seq 利用 DNase 来消化基因组的暴露区域，而与核小体结合的 DNA 不会被 DNase 消化。然 后对 DNase 消化产生的小片段进行测序并将其定位到基因组，以确定活跃转录的区域。 优势 • 最成熟和实用的实验方法 • 对 DNase 剪切的偏差有明确解释 • 可用于反向推导未被剪切的基因组区域，称为 DNase 足迹法，旨在鉴定转录因子和核小体的结合位点。但是此类实验中，使用裸 DNA 作为对照很重要，因为 DNase I 的剪切偏差也可能导致错误的结论 • 可能会适用于单细胞分析 缺点 • 实际应用中有难度，尤其是在针对给定细胞类型/数量设计消化条件的时候 • 需要几百万个细胞，可能不利于病人样本稀少的情况 。 MNase-seq 与 DNase-seq 不同，MNase-seq 利用金黄色葡萄球菌的微球菌核酸酶 (Mnase) 来消化掉暴露的基因组区域。然后对与核小体结合的 DNA 进行恢复并测序。 优势 • 从酵母到人类，是在众多种属的许多细胞类型中通用和成熟的实验方法并且消化和数据分析实现 了一定的标准化 • 可与染色质免疫沉淀测序 (ChIP-seq) 结合使用，用于研究与核小体结合的调控因子 • 可用于生成碱基对分辨率图谱 • 可用于检测核小体定位以及核小体占有率和甲基组测序(NOMe-seq) 中的 DNA 甲基化状态 缺点 • 需要大量细胞（1-2 千万） • AT 富集区消化过程中存在序列特异性偏差（尽管在染色质可及性检测中使用的大多数酶都表现出 了相似的偏差），但也存在未知 偏差可能导致错误的实验结果 • 尚不支持单细胞分析 ATAC-seq 转座酶可及性染色质分析测序 (ATAC)-seq 建立于 2013 年，使用 Tn5 转座酶将测序接头直接插入 DNA 的暴露区域。然后用 qPCR 扩增接头之间的 DNA 并测序。 ATAC-seq 使用了一个预先装载 DNA 接头的突变超活性 Tn5 转座酶，旨在对基因组进行酶切时，同 步标记被剪切的 DNA 片段（这个过程称为标签化）。带标签的 DNA 片段通过 PCR 扩增并做二代测序 NGS。一个区域中序列的频率与打开的染色质构象相关。 优势 • 最简便的实验方法：无需超声、酚-氯仿抽提、抗体 (ChIP-seq) 或酶消化 (DNase-seq、MNase-seq) • 最快速的实验方法：不到 3 小时即可完成，其他方案可长达 4 天 • 信噪比最佳 • 仅需 50000 个或更少的细胞（推荐使用 500-50000 个细胞） • 单核苷酸分辨率有望实现 • 通过采用流式细胞术/微流体技术的改编方案，可进行单细胞分析 缺点 • 费用较高，需要使用 Illumina 公司的试剂盒 (Nextera DNA Library Preparation Kit)。 • 成熟度较低，需要针对特定的细胞类型、组织和生物体优化细胞数量和裂解条件，才能获得理想的片段分布。 • 细胞数量决定数据质量，细胞过少或过多会导致过度转位或转位不足，从而导致错误的结果。 图 1：染色质结构。DNA 缠绕在核小体周围，形成染色质纤维，然后再形成染色体 紧密缠绕在核小体或更高阶异染色质中的 DNA 是无法与转录因子、转录机制和其他 DNA 结合蛋白 相结合的，从而导致基因沉默。但同时， “接头” DNA 和打开的常染色质结构却易于结合，允许活跃 的基因转录。 为了改变基因表达和细胞编程，染色质处于不断被重塑的动态中，例如在不同的发育阶段或响应特定 的刺激时。大的基因组区域可能被沉默，可能被激活，或者核小体被打开，以便特定的基因和 DNA 序 列与之结合。 对于染色质结构和核小体定位的探索揭示了与特定细胞进程和疾病状态相关的表观遗传程序和
图 2：ATAC-seq 实验方案。在此处查看 ATAC seq 分步指南。 染色体构象技术 我们可以通过染色质接触图谱（chromatin contact mapping）来评估染色质三维结构，从而揭示远距离基因组区域之间的物理相互作用。染色质构象捕获 (3C) 技术的出现与以此为基础发展的技术方法使 得这种类型的作图成为可能。每种方法对于特定应用都具有特殊的优势，基于方法学的多样性，根据特定的目的选择某一种方法具有一定的挑战性。 
图 3：染色体构象技术。3C、4C、5C、ChIA-PET 和 Hi-C 的不同步骤 染色体构象捕获 (3C) 3C 利用甲醛交联将 3 维染色质结构固定，然后进行限制性酶切。通过 qPCR 和测序分析切下的 DNA 片段，确定不同 DNA 区域的连接位置。这种用于分析 3D 染色质结构和相互作用的方法首次出现于 2002 年 (Dekker et al., 2002)，现已成为更大规模、更高通量或特异性分析的一系列相关技术的基础。 环状染色体构象捕获 (4C) 4C 能够识别与目标位点相互作用的未知 DNA 区域，因此是发现特定区域内新的相互作用的理想之选 (Dekker et al., 2006)。 提示： 选择合适的限制性内切酶。内切酶越频密（例如 4 个 bp 识别位点），对研究目标区域和同一染 色体上邻近序列之间的局部相互作用越好 (van der Werken et al., 2012)。 优化交联步骤。较低的甲醛浓度会促进目标区域的自连接，但同时也会阻碍限制性内切酶切割形 成的 DNA“hairballs”。较高的甲醛浓度能够降低自连接事件，但会增加“hairballs”。在特定的实验情况下，应优化选择最佳的甲醛浓度来平衡这些考量。对于大多数实验，可以从 1% 甲醛处理 10 分钟开始优化 (van der Werken et al., 2012)。碳拷贝染色体构象捕获 (5C) 5C 会形成与目标位点相结合的 DNA 区域的连接产物文库，然后进行 NGS 分析。当需要了解目标区 域的所有相互作用，例如需要绘制特定染色体的详细相互作用矩阵，那么 5C 是理想之选。但是，5C 不是真正的全基因组，因为每个 5C 引物必须单独设计，所以 5C 最适合某一特定区域 (Dotsie and Dekker, 2007)。 提示： 选择合适的限制性内切酶。在您的实验条件下选择一种高效的酶很有必要。例如，大多数情况不 推荐 BamHI，因为它在 3C 条件下效率低 (Dotsie et al.,2007)。 优化引物设计。5C 使用了两种引物：结合在连接位点上游的正向引物和紧邻下游的反向引物。应调整引物长度，以便退火温度在 65°C 左右，从而确保引物与其限制性片段完全退火。确保 5C 引物在合成时 5’ 端有磷酸化位点，用于连接。 使用对照模板。这样可以控制引物效率方面的差异。推荐构建研究中整个基因组区域的对照文库。 如果不构建对照文库，相互作 用强度的精确性会降低。利用配对末端标签测序的染色质相互作用分析 (ChIA-PET) ChIA-PET 结合染色质免疫沉淀 (ChIP) 和 3C 的特征，通过特定蛋白来分析远端 DNA 区域的相互作用。 ChIA-PET 最适用于发现目标蛋白与未知 DNA 的相互作用，例如研究转录因子的结合位点。因为在体内 DNA 就与转录因子结合，产生了相互作用 (Fullwood et al., 2009)。 提示： 重叠 PET 标签以减少背景。与大多数 3C 技术一样，背景噪音是个挑战。特别是在 ChIA-PET 中， 背景噪音增加了发现与目标位点远距离相互作用的难度。有一个实用的小技巧，就是要求 PET 在 区域的两端重叠，可以远距离相互作用。 ChIP-loop ChIP-loop 是染色质免疫沉淀 (ChIP) 和 3C 的结合，其采用的抗体靶向至疑似结合目标 DNA 区域的蛋白。当确认两个已知的 DNA 区域是否与目的蛋白有相互作用，ChIP-loop 是理想之选。它适合用于确认疑似的相互作用，但不适用于发现新的相互作用 (Horike et al., 2005)。 提示： 避免非天然环。ChIP-loop 的最大问题在于连接发生前的 DNA 浓缩过程中会形成非天然环。有一 个简单的方法可以避免这种情况，那就是选择一个在连接步骤完成后再进行沉淀的方案 (Simons et al., 2007)。 验证 ChIP-loop 的相互作用。另一个挑战是连接产物的准确定量。3C 技术，特别是 ChIP-loop， 通常会捕捉随机的相互作用。为了解决这个问题，可以考虑同时进行一个 ChIP 实验来验证 ChIP-loop 的相互作用。如果 ChIP-loop 得到的 DNA-蛋白-DNA 相互作用的确属实，那么两种 DNA-蛋白的相互作用也会在 ChIP 数据中体现 (Simons et al., 2007)。 Hi-C Hi-C 扩增与从全基因组得到的连接产物，然后通过高通量测序评估其频率。如果需要广泛覆盖全基因组，Hi-C 是一个很棒的选择，而且无需担忧分辨率。例如，绘制肿瘤细胞染色体结构的全基因组变化 (Lieberman-Aiden et al., 2009)。 提示： 优化文库扩增。Hi-C 文库扩增必须生成足够的产物用于分析，同时避免 PCR 不真实产物。为此， 应优化 PCR 循环次数（保持在 9-15 个循环范围内）。如果不能产生足够的产物 (50 ng DNA)， 应合并多个 PCR 反应，而非增加循环次数，通常 5 个反应就足够了 (Belton et al., 2012)。 平衡读长。与任何测序实验一样，高质量的读取至关重要。读长必须是平衡长读映射相互作用的 需要的最佳读长，但不能太长，以通过连接点进入伴侣片段。因此，在大多数情况下，50 bp 是最佳读数 (Belton et al., 2012)。 选择合适的测序单元大小。这一点对于数据分析至关重要。测序单元大小应与区域中预期相互作用的数量成反比。对于较为频繁的染色体内相互作用，使用较小的测序单元 (bin)；对于较不频繁的染色体间相互作用，使用较大的测序单元 (Belton et al., 2012)。Capture-C Capture-C 将 3C 和寡核苷酸捕获技术 (OCT) 相结合，加上高通量测序，一次可研究数百个位点。如果既需要高分辨率，又需要全基因组范围，Capture-C 是理想之选。例如，分析基因组中每个疾病相关 SNP 对局部染色质结构的功能影响 (Hughes et al., 2014)。 提示： 谨慎选择探针位置。最好将探针靠近限制性内切酶位点，如有可能，探针甚至可以与该等位点重叠 (Hughes et al., 2014)。 保持文库的复杂性。维护文库的复杂性是当务之急。复杂的文库意味着输出中有更多高质量的交互作用。因此，应避免任何可能降低文库复杂性的操作，例如 Hi-C 生物素捕获 (Hughes et al., 2014)。 观察重复区域中的错误交互。绘图过程可以刺激实际为人工产物的这些区域（例如假基因）之间的强相互作用 (Hughes et al., 2014)。 参考文献 Belton JM, McCord RP, Gibcus JH, Naumova N, Zhan Y and Dekker J (2012). Hi-C: a comprehensive technique to capture the conformation of genomes. Methods, 58, 268-76. Dekker J, Rippe K, Dekker M and Kleckner N (2002). Capturing chromosome conformation. Science, 295, 1306-1311. Dekker J. (2006). The three ‘C’ s of chromosome conformation capture: controls, controls, controls. Nat Methods, 3, 17-21. Dostie J and Dekker J (2007). Mapping networks of physical interactions between genomic elements using 5C technology. Nat Protoc, 2, 988-1002. Dostie J, Zhan Y and Dekker J (2007). Chromosome conformation capture carbon copy technology. Curr Protoc Mol Biol, Chapter 21, Unit 21.14. Horike S, Cai S, Miyano M, Cheng JF and Kohwi-Shigematsu T (2005). Loss of silent-chromatin looping and impaired imprinting of DLX5 in Rett syndrome. Nat Genet, 37, 31-40. Fullwood MJ, et al. (2009). An oestrogen-receptor-alpha-bound human chromatin interactome. Nature, 462, 58-64. Lieberman-Aiden E, et al. (2009). Comprehensive mapping of long-range interactions reveals folding principles of the human genome. Science, 326, 289-293. Hughes JR (August 2014). Email interview. Hughes JR, et al. (2014). Analysis of hundreds of cis-regulatory landscapes at high resolution in a single, high-throughput experiment. Nat Genet, 46, 205-212. Simonis M, Kooren J and de Laat W (2007). An evaluation of 3C-based methods to capture DNA interactions. Nat Methods, 11, 895-901. van de Werken H, de Vree PJ, Splinter E, Holwerda SJ, Klous P, de Wit E and de Laat W (2012). 4C technology: protocols and data analysis. Methods Enzymol, 513, 89-112 |
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