微塑料对小鼠生长和小肠结构的影响

塑料由于具有较强的可塑性及其低成本、耐水、耐高温等特性被广泛应用于各个领域。全球塑料年产量逐年增加，按照目前的需求、生产速度，Rochman等[1]估计到2050年全球的塑料制品产量可能达到330亿t。常见的塑料成分包括聚氯乙烯（PVC）、聚碳酸酯（PC）、聚乙烯（PE）、聚苯乙烯（PS）等，这些塑料广泛用于我们的生活当中，使用后的塑料垃圾排放于环境后由光热降解、生物降解、机械磨损等途径进入环境中形成粒径小于5 mm的微塑料[2]。Browne等[3]调查横跨六大洲海岸，包括澳大利亚、日本、阿拉伯联合酋长国、菲律宾等世界各地18个地点均发现微塑料污染，连人迹罕至的南极也不例外[4]。微塑料也被报道在淡水、土壤、空气中检出，海洋污染更甚[5-8]，由于微塑料体积较小且广泛分布于水体和土壤环境中，极易被生物采食而进入食物链中。

海洋中有多种海洋生物例如藻类、贝类及一些海洋哺乳类动物直接或间接地将微塑料摄入体内并进一步累积[9-11]，从而影响生物的各项生理及生化指标，对机体造成一定的毒性与伤害。大量的研究报道了水体污染的微塑料对水生生物造成的机体损害。体内的微塑料影响了中华绒螯蟹的免疫酶活性和免疫相关基因表达，改变了肠道菌群的多样性和组成[12]；改变一些浮游生物的行为特性[13]；改变斑马鱼肝脏酶的活性从而加重体内重金属离子的富集，进一步加重毒性作用[14]、导致斑马鱼代谢紊乱及微生物菌群的失调[15]；导致金鱼胃肠道系统的损害[16]；对海虾的肠道上皮细胞造成破坏，导致微绒毛数量减少、排列紊乱，细胞内线粒体和自噬体增加[17]。也有报道表明，微塑料对人的Caco-2细胞系有明显的毒性作用，并抑制细胞膜离子泵的外排作用[18]。可以推测出经由食物链，微塑料最终会进入陆生动物的体内、产生积累甚至对动物脏器产生不可逆的伤害。本文以小鼠为试验对象，通过饲喂掺杂微塑料的鼠粮，观察微塑料对小鼠生长和肠道结构的影响，以判断食源性微塑料是否会对哺乳动物消化系统造成功能障碍。

本实验室自繁自养的清洁级昆明小白鼠，雌性，25只，体质量约23 g，30日龄。

微塑料粉聚苯乙烯（PS）和聚乙烯（PE）购于迈森生物公司，过600目网筛。

挑选体质量相近的小鼠25只，随机分为5组，每组5只。对照组饲喂正常鼠粮，其余4组为微塑料添加组，分别为PE（0.3%）组、PE（3%）组、PS（0.3%）组和PS（3%）组。小鼠饲喂27 d，每组小鼠定时定量投喂，每3 d添加120 g鼠饼，期间自由采食与饮水，小鼠日平均饮食6~8 g鼠饼。

按表 1配方制作对照组鼠饼，试验组为添加不同剂量的微塑料组，0.3%添加组按3 g·kg-1鼠粮添加微塑料，3%添加组按30 g·kg-1鼠粮添加微塑料。

分别在开始试验的第1、9、18、27 d记录小鼠体质量，检测整个饲喂过程小鼠体质量的变化，并计算平均每组小鼠的体质量差值与相对体质量差值。体质量差（g）=终末体质量（g）-初始体质量（g）；相对体质量差=[终末体质量（g）-初始体质量（g）]/初始体质量（g）。

于饲喂第27 d将各组小鼠进行剖检，观察小鼠肠道有无病理变化，每组取3只小鼠分别采集十二指肠、空肠、回肠各5 mm左右，生理盐水冲洗肠道内容物，放入装有4%甲醛固定液的EP管中备用。

组织块样品流水冲洗14 h，经酒精脱水、透明、浸蜡、包埋、修块、切片、展片和粘片后，HE染色，树脂封片。

各组内数据计算平均值与误差，试验处理组与对照组采用t检验进行两两比较分析。

显微镜观察微塑料颗粒，大小较均一，微塑料颗粒在20 mm左右（图 1）。

在整个小鼠饲喂周期内，采取定时投料，即每隔3 d投鼠料一次，每次120 g，期间小鼠自由采食，每只小鼠的日进食量在6~8 g左右。对照组与微塑料添加组各小鼠饮食均正常，粪便正常，未见厌食、食欲不振等现象。称量饲喂周期内各组小鼠的体质量，结果表明（图 2）：对照组各小鼠体质量均呈逐渐增长趋势；微塑料添加组在饲喂的前9 d，大部分体质量有所增长，但在后续的时间大部分小鼠出现体质量停滞甚至下降的现象。

对照组小鼠在饲喂周期内体质量逐渐增长，平均体质量增加7.34 g，微塑料添加组与对照组相比体质量增长缓慢，出现停滞，甚至呈下降趋势（图 3a），其中PE（0.3%）组体质量平均增加1.84 g，PE（3%）组小鼠平均体质量减少0.12 g，PS（0.3%）组小鼠平均体质量增加0.86 g，PS（3%）组小鼠平均体质量增加0.16 g，各微塑料添加组与对照组相比差异极显著（P < 0.01）。微塑料添加组相对体质量增长差也极显著小于对照组（P < 0.01）（图 3b）。

小鼠剖检，所有组别的小鼠小肠均无肉眼可见的病理变化。肠道内容物颜色、状态无异常。

对照组小鼠十二指肠切片在光学显微镜下可见小肠绒毛细长，排列整齐，刷状缘清晰，上皮细胞完整呈柱状，杯状细胞较多且均匀分布，隐窝深度适中，形态结构清晰（图 4a、图 4b）。与对照组相比，PE（0.3%）组小鼠的十二指肠切片中可清晰看到小肠绒毛细长但破裂，上皮细胞形态结构完整，杯状细胞数量减少，隐窝形态结构基本完好但深度变深（图 4c）。PE（3%）组小肠绒毛长度变短，顶端破裂（图 4d箭头处），杯状细胞数量减少，隐窝形态不清晰、数量减少。PS（0.3%）组十二指肠绒毛大部分形态结构消失，绒毛变短，杯状细胞数量减少，有少量结构完整的隐窝（图 4e、f）。PS（3%）组小肠绒毛明显变矮且部分小肠绒毛结构形态消失，杯状细胞数量减少，隐窝形态结构基本完整但数量减少（图 4g、图 4h），黏膜基层有颗粒物聚集（图 4h箭头处）。

对照组小鼠空肠在显微镜下观察，小肠绒毛细长排列整齐，上皮细胞形态结构完整清晰，杯状细胞均匀分布且数量较多，隐窝形态结构清晰（图 5a、b）。与对照组对比，PE（0.3%）组小鼠空肠小肠绒毛断裂，杯状细胞数量减少，隐窝形态结构完整且数量较多，内含未知颗粒（图 5c）。PE（3%）组小肠绒毛变矮、肿胀，杯状细胞数量减少，但隐窝结构清晰，深度适中（图 5d、图 5e）。PS（0.3%）组小肠绒毛形态不清晰，黏膜固有层消失，上皮细胞形态结构完整，杯状细胞减少（图 5f）。PS（3%）组小鼠空肠绒毛基本消失，无清晰形态结构，残留有少部分上皮细胞，有少量隐窝但结构不清晰（图 5g），黏膜基层基本消失（图 5h）。

对照组小鼠回肠绒毛细长，排列整齐，刷状缘清晰，上皮细胞完整呈柱状，杯状细胞较多，均匀分布（图 6a），但隐窝内有颗粒物质（图 6b）。与对照组相比，PE（0.3%）组的回肠切片，小肠绒毛变矮，边缘不清晰（图 6c），隐窝有未知颗粒（图 6d）。PE（3%）组回肠小肠绒毛高度差异不大，绒毛破损、融合，杯状细胞萎缩，数量减少，隐窝结构不清晰（图 6e）。PS（0.3%）组小肠黏膜下层增生变厚（图 6f）。PS（3%）组小肠绒毛长度无太大变化但是形态改变，杯状细胞数量减少，隐窝可见有未知颗粒（图 6g），肠道黏膜下层及肌层增生变厚（图 6h）。

塑料制品在生活中的广泛应用导致其降解后的微塑料污染已经渗透到各个领域。中国国家海洋监测局检测得2016年我国海域渤海、东海、南海表层水漂浮微塑料数量密度为0.29个·m-2，海滩微塑料最高为1028个·m-2[19]。在国内武汉汉江及长江流域、珠江流域、太湖、洞庭湖这些内陆湖泊均检出微塑料[20-23]。研究人员采集上海郊区的20个菜田土壤进行检验，这些土壤样品中也均检出微塑料[24]。微塑料不仅存在于环境中，在海洋生物体内的报道更是不胜枚举，最近报道在宠物犬和宠物猫的饲料和粪便中也都有检出，在狗粮中微塑料PET检出为1.5~12 mg·g-1，猫粮中检出为1.5~4.6 mg·g-1，在宠物狗粪便中的检出则高达7.7~190 mg·g-1，在猫粪便中高达2.3~340 mg·g-1[25]。可见微塑料的渗透以及污染早已不局限于海洋，环境微塑料终将通过食物链从海洋、土壤，经生物富集进入食品并进入人体内。

虽然微塑料在水生生物体内的聚集以及生理毒性的报道已不在少数，但在哺乳动物体内及其生物毒性的报道并不多。本研究利用小鼠饮食中添加微塑料来观察摄入微塑料对小鼠的影响，结果表明在饲料中添加微塑料会使发育期小鼠在整个饲喂周期体质量增长显著降低（P < 0.01），甚至体质量降低，并且体质量的增长与微塑料的摄入量成反比，但是对于两种不同的微塑料（PS和PE）对体质量的增长影响并没有发现显著的差异作用。而在开始的9 d饲喂周期中，我们发现，小鼠的体质量都是一个增长的状态，体质量的降低出现在饲喂的中后期。这些结果表明，微塑料进入动物体内会干扰动物的营养吸收，导致体质量降低，并且这种干扰作用需要时间的积累。有类似报道表明，黄鱼摄入微塑料会减缓增长速度，并且体长增长速度与微塑料颗粒大小负相关[26]，对水溞的研究表明，微塑料的摄入会导致水溞行为的改变，包括生长增殖、趋光性以及繁殖行为的改变，显著抑制生长速度，并导致父系水溞的死亡[13, 27]。也有文献表明微塑料的摄入会影响一些浮游生物的行为[13]。这些报道与本研究结果基本相符，但在本试验观察中，微塑料的摄入并没有对小鼠的生理行为产生明显的影响。饲喂过程中，小鼠精神状态正常，饮食、饮水、活动均没有表现出任何异常。但也有报道表明，贝母持续暴露在微塑料养殖环境中并不会产生任何生理影响，包括体质量增长和繁殖行为[28]。可见微塑料对不同物种或许有不同的影响。

为了观察微塑料对小鼠肠道结构的影响，解剖小鼠后发现，整个肠道并没有眼观的明显病变，肠道内容物的性状也正常。但是在肠道的显微结构观察中，我们发现，与对照组小鼠相比，添加不同微塑料的小鼠肠道结构均有不同程度的改变，如肠绒毛肿胀、变短、杯状细胞减少、黏膜下层增生等现象，并且在肠道隐窝结构以及黏膜下层观察到聚集的颗粒，其颗粒大小与微塑料粒径相符。肠绒毛的高度与小肠的吸收能力呈正比。杯状细胞分泌的黏蛋白，对肠道有润滑和保护的作用而且还可以防止微生物入侵肠上皮细胞与隐窝。隐窝的深浅也与肠道分泌、消化、吸收息息相关。在所有添加微塑料的组别中均出现小肠绒毛变短、隐窝形态结构异常、杯状细胞数量减少。从部分小鼠的体质量不升反降可看出，这些结构的改变会使得肠道的消化与吸收能力减弱，对生物体造成损害。Deng等[29]采用荧光技术和原始聚苯乙烯微塑料，研究了微塑料在小鼠体内的组织分布、积累，结果表明微塑料会在小鼠的肝脏、肾脏和肠道中积累，并且加剧有机磷阻燃剂（OPFRs）对小鼠体内的生物毒性，造成代谢组学的严重紊乱[30]。体内聚集的微塑料也会导致小鼠肠道菌群的紊乱，肝脏代谢的异常与脂代谢的紊乱[31]。鉴于本研究结果与已有的报道，有理由推测，微塑料在小鼠肠道的聚集以及对肠道显微结构的破坏影响了小鼠的生理特性，造成小鼠的生长增殖过程中出现体质量减轻。究竟积累的微塑料是否对小鼠还有其他的生物毒性作用还需进一步研究。

目前已有多篇文献报道微塑料在海洋食物链中转移和富集[32]，但是依然鲜有报道在哺乳动物以及人体内的转移和毒性作用，水产品和畜产品的食用将是微塑料进入食物链的一个重要的途径，相关试验数据还需要大量积累补充。

（1）饲料微塑料的摄入会聚集在小肠，破坏小鼠小肠显微结构，从而影响小鼠生长，显著减缓体质量增加。

（2）同浓度不同类型微塑料（PE和PS）对小鼠肠道结构与生长的影响没有显著差异。