同位素标记的分类及应用

同位素标记是用一种同位素代替某一化合物分子中的相应元素的过程。同位素为质量不同但化学性质相同的同一种元素。把分子中的某一原子用它的同位素来代替的方法叫做同位素标记。同位素有放射性和非放射性两种，目前在生物学中常用放射性同位素来标记，它具有检测方便、灵敏度高等特点。同位素标记可以用于研究物质代谢，例如13N可以用来代替14N研究某个含N化合物在体内的合成或分解情况。又如可用放射性14C代替12C研究某化合物的某个C原子的代谢情况。放射性同位素标记目前还用于抗原、抗体及核酸的检测等，在医学实验中也可以用作为追踪药物作用部位和代谢的手段。用放射性同位素或稳定性同位素的原子作为示踪原子取代化合物分子中相同元素的普通原子使整个化合物带有特殊标记的方法。从另一角度看，标记化合物与普通化合物区别在于同位素组成比例不同。所以同位素标记法也就是人工改变化合物的同位素组成比例的方法。同位素标记方法有同位素交换法、生物合成法、化学合成法、核反应法等。

体内标记又称代谢标记，主要是通过细胞或者生物体(主要是指简单的生物体)正常的生长代谢实现目标生物分子的稳定同位素标记，其操作简便、高效、相对准确。该方法的优点是：由于稳定同位素的引入是在细胞或生物体生长过程及蛋白质转换中引入，对蛋白质样品标记较完全。样品组和对照组样品可以在单独收集后直接合并进行后续的样品处理及液质分析，重质和轻质同位素标记的同一蛋白质互为内标，避免了在样品标记、处理及分析等过程出现的误差，因而确保了相对定量结果的准确性。它是最早被引入蛋白质组学研究领域的同位素标记技术。而其主要缺点是要求该方法的生长条件精细可控，由于受到饲喂条件限制，主要适用于较为简单的单细胞生物体，如细菌、酵母及细胞培养体系的蛋白质相对定量研究，不适用于复杂组织、器官的样品分析。虽然随着研究的深入，代谢标记技术也逐步在多细胞生物体系中得以应用，如新杆状线虫、黑腹种果蝇、大鼠、小鼠和植物中，但实验难度大幅增加。

1）15N/14N 标记技术：通过控制生物培养体系中的14N/15N 来源，可实现对生物样品及其对照组分别进行系统性的14N 和15N 标记，用于比较含N 生物分子的相对含量变化。

2）细胞培养氨基酸稳定同位素标记(SILAC)：为了克服上述标记策略的不足，在细胞培养过程中将稳定同位素标记的氨基酸直接添加至细胞培养体系中，利用细胞培养体系对氨基酸的代谢吸收，实现该体系的同位素标记，后经分离、酶解等步骤，再结合后续的MS 技术能够对蛋白表达进行相对定量分析，所建立的方法称之为细胞培养氨基酸稳定同位素标记技术(stable isotope labeling withamino acids in cell culture，SILAC)：

由于该技术通过细胞的正常生长代谢将稳定同位素标记的氨基酸引入到蛋白质中，这就大大简化MS 定量分析前人工处理的复杂度。目前，通过S ILAC 技术可实现细胞培养体系的2H，13C 以及15N等稳定同位素的标记。

与利用生物体生长代谢实现同位素标记的体内标记技术不同的是，体外标记技术采用化学手段在样品取材后的处理过程中实施目标生物分子的同位素标记，主要包括酶解标记和化学标记2大类。酶解标记是在蛋白质酶解过程中加入含有稳定同位素的试剂，将含有重同位素基团或者分子引入到蛋白质或者肽段中，主要适用于蛋白质等大分子。化学标记需要根据目标生物分子的特定官能团结构特点，通过人工设计合成能够与之发生专属性化学反应的稳定同位素标记的衍生化试剂，实现同位素标记，该策略能够实现对蛋白质、肽段或其他小分子的标记，较酶解标记使用领域更为广泛。

1）化学标记

同位素标签衍生化技术(stable isotope coded derivatization，ICD可以将不同同位素标记形式的质量差异标签引入目标组分进行相对定量分析，其基本原理是：将一种同位素标签与一份样品衍生化反应，另外一个质量差异的标签需要与另外一种样品衍生化，然后将同时被轻质同位素和重质同位素标记的样品按比例混合后用液质联用技术(LC/MS)分析，最后根据被不同同位素标记的分析物产生离子对的峰面积比值对样品中的待测组分进行相对定量分析。

利用同位素标签衍生化技术，可以对含有相同功能基团的系列组分实现同位素标记，是解决多组分代谢相对定量分析的有效方法。尤其适用于对复杂基质样品里的目标成分进行准确地定量分析，需要说明的是，如果一组样品是已知浓度的标准品，那么就可以用这种方法对样品中的待测组分进行绝对定量，其工作流程见图。

同位素标记可以用于研究物质代谢，放射性同位素标记目前还用于抗原、抗体及核酸的检测等，在医学实验中也可以用作为追踪药物作用部位和代谢的手段。

1. 同位素标记在汞的生物地球化学研究中的应用。汞( Hg) 是一种人体非必需的有毒重金属元素。不同形态汞的毒性相差很大，其中甲基汞( MeHg)是毒性最强的汞化合物，具有极强的神经毒性，另有心血管、生殖、肾脏等毒性和致癌性、干扰/破坏免疫系统效应等。

目前，有许多研究手段和方法用于环境汞污染和汞的生物地球化学研究，如：分析环境中形态汞的时空分布特征，结合野外监测和室内模拟研究，揭示环境中汞的迁移及转化和在不同环境介质中的分配，评价环境风险；长期监测背景地区大气总汞和形态汞变化，研究人为活动和自然源排汞对全球大气汞循环的影响。同位素标记技术借助放射性同位素或富集稳定同位素的示踪特性来研究元素的行为，是生物地球化学循环研究的重要手段之一。同位素标记技术利用同位素作为标记制备成含有同位素的标记化合物或单质，加入环境后标记物也参与环境中该元素的物理化学反应和生物地球化学过程，通过分析相应的环境介质、物相或特定形态化合物中放射性同位素或富集稳定同位素的含量，就可以计算环境中该元素特定途径迁移和转化的量。

2. 稳定同位素标记技术在生物分子相对定量分析研究中的应用。同位素标记技术的主要应用对象是生物大分子，但近年来在生物小分子定量分析领域也取得积极进展。例如，通过衍生化手段，可对目标小分子化合物的氨基或羧基等官能团进行同位素标记，借助所引入的同位素标签，不但能实现上述生物分子的相对定量分析，更为提升部分目标化合物的检测灵敏度提供可能。

目前，生物分子相对定量分析中所用到的同位素标记手段主要包括稳定同位素标记和放射性同位素标记两大类，稳定同位素标记(stable isotope labels，SIL)是利用非放射性的稳定同位素对代谢途径或体内发生的生化反应进行标记，并与非放射性的普通同位素标记的组分进行比较分析，确定相对含量变化；放射性同位素标记是利用放射性同位素对上述生理过程及中间体进行标记，利用对放射性同位素衰变后所发出的辐射强度进行测量来对标记物进行检测分析。

[1] 中国成人教育百科全书·生物·医学

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