细胞实验

· 原理 ·

巨噬细胞是机体免疫系统的重要细胞成分，具有抗感染、抗肿瘤和参与免疫应答、免疫调节等生物学功能。腹腔巨噬细胞多游离存在于腹水中易于获得。因此，可以通过向小鼠腹腔内注射刺激物制造无菌炎症环境以积聚巨噬细胞，来进行巨噬细胞研究。以下为具体实验方案。

· 检测步骤 ·01材料

昆明小鼠，SPF级，体质量18～22 g，雄性，6～8周龄。

02肉汤制备

6%淀粉肉汤制备 

将1.0g胰蛋白胨、0.3g牛肉浸膏和0.5g氯化钠放入盛有100 mL双蒸水的烧杯中，置于磁力搅拌器常温溶解后121℃灭菌30min，于4℃保存。

3%巯基乙酸盐肉汤的制备

1L双蒸水中加入29g巯基乙酸盐，煮沸使其完全溶解，玻璃瓶或离心管分装后121℃灭菌15min，4℃保存，使用前确保已经冷却。

03巨噬细胞的诱导

每次腹腔注射3%巯基乙酸盐肉汤1mL，每天1次，3d后用预冷PBS灌洗腹腔2次。

04巨噬细胞的收集

准备75%乙醇，以脱颈方式处死小鼠，浸泡3min。取出，置于无菌操作台，仰卧位固定小鼠，右手持注射器于右下腹部将针头刺入皮下进入腹腔，将5mL预冷的PBS(培养液组为5mL预冷的10%血清ＲPMI 1640培养液) 注入腹腔，按摩小鼠腹部5min。无菌条件下剪开小鼠腹部皮肤显露胸腹部，用无菌止血钳提起剑突处组织，无菌剪刀在该处剪开约1mm2小口。注意止血钳保持提起状态，用无菌巴氏吸管从腹腔开口深入腹腔，反复冲洗腹膜腔灌洗液2次，可回收约8mL 淡黄色灌洗液。

05巨噬细胞的纯化与培养

将每只小鼠的灌洗液于常温条件下1000r /min 离心10min，所得细胞沉淀用ＲPMI 1640培养液重悬接种，培养体系于37℃静置培养2～3h后洗去未贴壁细胞，余下的贴壁细胞即为巨噬细胞。

06巨噬细胞形态学观察及计数

细胞贴壁培养24h后在倒置显微镜下观察各组细胞形态。用0.5%胰酶消化细胞，离心弃上清液，PBS重悬得到细胞悬液，用细胞计数板计数每只小鼠腹腔中分离的巨噬细胞数量。

07台盼蓝染色检测巨噬细胞活性

将500μL“1.6中”的各组巨噬细胞悬液和500μL台盼蓝染液(0.4%浓度) 加入3.5cm培养皿，摇匀后静置3～8min; 吸取1滴混合液滴入载玻片，3min内镜下计数巨噬细胞200个，分别统计活/死细胞数目(死细胞呈蓝色，活细胞无色透亮) ; 细胞活性(%) = 活细胞数/200×100%。每组检测重复3次。

· 注意事项 ·

小鼠腹腔注射刺激物时不要刺破内脏，可以在操作过程中将小鼠头部向下抓取，使其腹部内容物滑向膈下以避开注射器针头; 若回收的小鼠腹腔灌洗液过少，可另外注入预冷的PBS重复灌洗；若不小心致腹腔出血，可在腹腔液离心后重悬时加入5倍细胞悬液体积的红细胞裂解液，再次离心弃上层红色液体。