胚胎干细胞向中内胚层分化的调控机制

哺乳动物的胚胎发育进入桑椹胚胎期后，细胞在不断分裂时会形成内部含有空腔的囊胚，其中处于外部的细胞被称为滋养外胚层(trophectoderm, TE)，在随后的发育过程中形成胎盘，而滋养外胚层细胞所包裹的空腔内部还有一小团细胞被称为内细胞团(inner cell mass, ICM)，这些细胞随后分化发育为整个胎儿。小鼠囊胚的内细胞团大约含有12个细胞，包裹在外部的滋养外胚层的细胞为20~24个[1-2]。根据细胞极性不同，内细胞团又分为靠近滋养层细胞的上胚层(primitive ectoderm，或称epiblast)和靠近空腔的下胚层(primitive endoderm，或称hypoblast)。上胚层细胞在胚胎发育的第4.5~5.5天开始进行原肠胚发育(gastrulation)，在形成中胚层与内胚层之前，细胞会先形成原条(primitive streak)，这种细胞状态相当于体外分化系统中的中内胚层(mesendoderm)。原条沿其中线延伸，形成身体左右、头尾两条对称轴线，标志着原肠胚发育的开始，在这一过程中，细胞由紧密连接的状态逐渐变得松散，有一部分细胞内陷并迁移形成中胚层(mesoderm)和内胚层(endoderm)，与上胚层剩余细胞分化形成的外胚层共同组成完整的原肠胚[3-4]。胚胎干细胞则是将分离的内细胞团在合适的体外培养条件下建立起来的，这些细胞同样具有分化发育为完整三胚层以及后续组织器官的能力，因此可作为研究胚胎发育和疾病发生的理想生物模型[5]。

体外诱导中内胚层分化的研究对于了解早期胚胎发育过程至关重要，目前已有大量研究证明，在原条期或在中内胚层存在一类标记基因，它们不仅在这一时期表达量较高，同时在中内胚层的分化过程中起重要作用，例如T-box转录因子T (Brachyury)，可以调控大量发育相关基因的表达，在中内胚层分化过程中发挥重要作用[6-7]，其他的标记基因还包括MIXL1[8-9]、EOMES[10]、NODAL[10]、FGF8[11]和WNT3[12]等等。

由胚胎干细胞向中内胚层的分化受到细胞内转录因子和细胞外生长因子的共同调节，在众多生长因子中，转化生长因子-β (TGF-β)超家族成员(Activin、Nodal、BMP4)、Wnt家族成员和成纤维细胞生长因子(FGF)均发挥了重要作用[12-17]；同时，随着对组蛋白修饰和染色体调控因子的深入研究，人们发现表观遗传修饰H3K4me3、H3K9me3和H3K27me3以及调控因子EZH2、JMJD3和UTX等均在原条形成和中内胚层分化过程中发挥重要调节作用[18-21]。本文就中内胚层分化过程中的调控机制的研究进展进行简单概述。

在体外胚胎干细胞定向分化为中内胚层的研究中，多个信号通路被证明在其中发挥了重要作用，包括TGF-β信号通路、Wnt信号通路以及FGF信号通路，它们之间相互协同共同决定了胚胎干细胞的分化命运[22-23]。

TGF-β超家族包括众多生长因子，如TGF-β、Nodal、Activin、BMPs和GDFs等。这些由细胞分泌的生长因子通过与对应的细胞膜表面的丝氨酸/苏氨酸激酶受体(包括Ⅰ型受体和Ⅱ型受体)结合，实现信号由胞外向胞内的转导[24-25]。在结合配体后，Ⅱ型受体会磷酸化Ⅰ型受体，后者进而磷酸化并激活细胞质中的R-Smad蛋白，磷酸化的R-Smad蛋白和Smad4形成复合物进入细胞核与DNA结合，继而控制下游靶基因的转录。由于配体受体的特异性，不同的TGF-β超家族因子激活的R-Smad也不同，Activin与Nodal激活并利用Smad2/3介导信号转导，而BMPs则利用Smad1/5/8，但它们都需要Smad4来传递信号。

TGF-β信号在胚胎干细胞干性维持过程中发挥着重要作用，Smad2可以结合在干性因子Nanog的调控区正向调控其表达，维持细胞干性；当敲低Smad2后，干性因子表达降低，细胞开始向中胚层以及滋养外胚层分化[26]。在小鼠胚胎干细胞中，BMP信号可以协同LIF信号共同维持细胞干性[27-28]，BMP通过Smad1/4上调ERK磷酸酶Dusp9的表达，从而抑制由LIF激活的ERK活性，促进细胞干性维持[29]。虽然TGF-β信号在维持细胞干性过程中发挥作用，但在胚胎干细胞分化过程中其功能更加明显。

Activin/Nodal信号在原肠胚形成过程中起关键作用。原肠胚形成之前的上胚层细胞中，Nodal就有表达，其作用区域出现在上胚层后侧，这里正是原条形成的地方[30]。Nodal突变会导致胚胎滞留在卵圆柱期并且无法形成原条[31]。作为Activin/Nodal信号的下游信号介导分子，Smad2同样在早期胚胎发育过程中起重要作用，Smad2缺失的小鼠不仅着床后的胚胎较小，其胚层的组织发育严重受阻[32]。体外胚胎干细胞的研究同样证实Activin/Nodal信号对于中内胚层的分化至关重要，通过小分子抑制剂SB431542阻断Activin/Nodal Ⅰ型受体活性或是敲低Smad2后，中内胚层的分化均会受到不同程度的抑制[33-34]。

大规模高通量测序技术(如RNA-seq和ChIP-seq)得到的数据显示，在Activin/Nodal信号激活后，Smad2/3/4复合物会结合到中内胚层标记基因T、Mixl1、Eomes等的调控区域，从而促进标记基因的表达[35]。同时，这些标记基因有一部分本身作为转录因子，继续放大信号，进而激活其他下游的中内胚层基因，共同影响细胞向中内胚层分化[9]。Smad2/3还可以与其他辅助因子相互作用，如Foxh1以及Mixer，这些因子同样可以结合在特定基因的启动子区域，共同激活下游靶基因[14, 36-37]。

BMP信号在胚胎发育过程中也发挥了重要作用。在原肠胚形成之前的胚胎中，BMP4表达量较低，但在发育至原条后其表达量到达峰值，它参与了神经系统、肺、肾脏等不同组织器官的形成，缺失BMP4的小鼠胚胎在原肠胚时期就会出现明显缺陷[15, 38]。在小鼠胚胎干细胞中，BMP4信号不仅调控着胚胎干细胞干性的维持和滋养层细胞的分化，同样也调控小鼠上胚层干细胞和人胚胎干细胞向中内胚层的分化[39-40]。但是，BMP4信号在调控中内胚层分化过程中的作用较为复杂，并且该信号常常被认为是间接作用，因为当使用抑制剂Noggin或是敲低Smad1/5/8时，中内胚层的分化并未受到明显影响。有研究证实BMP不仅可以和FGF信号协同调控MAP激酶ERK的磷酸化，进而调控Dusp6和Nanog的转录，同时Smad1/5/8也可以调控中内胚层的标记基因[41]。因此，对于中内胚层分化这一生物学过程而言，BMP的具体功能还需更多的实验探究。

Wnt蛋白调控细胞增殖、分化、迁移以及极性等，在胚胎发育过起关键作用[42]。经典的Wnt信号是通过Wnt配体分子结合细胞膜上的七次跨膜受体Frizzled和共受体LRP5/6而起始，引起胞内Axin蛋白与Frizzled结合以及Dishevelled蛋白与LRP5/6结合，进而打散了由Axin、Dishevelled、APC和GSK3β等蛋白组成的β-catenin降解复合体，导致β-catenin积累并进入细胞核，同TCF蛋白形成复合物调控靶基因的表达[43]。在小鼠胚胎发育过程中，Wnt蛋白不仅在内细胞团中大量表达，同时在滋养外胚层中也可以检测到，β-catenin的表达量从内细胞团到原条期间都维持相对较高的水平，表明了经典Wnt信号在原肠胚发育和原条形成过程中的重要作用[44]。在体外胚胎干细胞分化实验中，激活Wnt信号可以诱导细胞向中内胚层分化，而通过DKK1或小分子IWR1抑制Wnt信号则极大地降低分化效率[45]。在数个激活经典Wnt信号的Wnt配体蛋白中，Wnt3的失活会造成原肠胚发育受阻以及原条的缺失。在体外分化实验中，Wnt3基因同样也是中内胚层的重要标记基因[46]。相反，通过非经典Wnt信号发挥作用的Wnt4、Wnt5a和Wnt11则无法在小鼠胚胎的原条区域中检测到表达，进一步说明β-catenin/TCF经典Wnt信号调控T、MIXL1等基因，在中内胚层分化过程中起重要作用[47]。

FGF信号在小鼠原肠胚发育阶段发挥重要作用。FGF信号是由配体结合膜表面的受体酪氨酸激酶启动，通过受体二聚化激活受体的酪氨酸激酶，从而导致下游PI3K/Akt通路的激活，产生生物学效应[48]。受体Fgfr1失活后，小鼠出现原肠胚期致死表型，同时，中胚层的形成也受到影响。虽然Fgf3、Fgf8、Fgf17在胚胎条纹期均有高表达，但只有Fgf8缺失的胚胎才会出现原条发育障碍和原肠胚发育缺陷[11]。在体外胚胎干细胞分化实验中，大量实验也证明了FGF信号可以协同BMP4、Activin等信号共同促进中内胚层的分化[41, 48]。

体外胚胎干细胞系的建立为深入了解胚胎早期发育过程中信号通路之间的相互作用提供了理想模型，通过不同的细胞因子处理，人们可以对特定的信号通路调控中内胚层分化进行详细的研究。利用胚胎干细胞，目前已经建立了多种体外中内胚层分化体系：(1) Activin信号协同FGF2以及PI3K抑制剂LY294002[33]；(2)高浓度Activin A[49]；(3)高浓度Wnt3a[50]；(4) BMP4协同FGF2或PI3K抑制剂LY29-4002[41]；(5)低浓度的Activin A和Wnt3a组合[21]。此外，BMP4单独处理同样也可以诱导中内胚层标记基因T的表达，但其中还伴随着滋养层标记基因CGa的表达[39, 41]。

大量的研究证明，多个信号通路通过复杂但精细的协调作用，维持着胚胎干细胞干性和分化状态的动态平衡[22, 34]。单独使用Activin A或Wnt3a处理均可以促进中内胚层分化，而不论是使用哪种生长因子，如果抑制Activin或Wnt信号，分化过程会受到不同程度的抑制[21]，说明Activin和Wnt信号在中内胚层分化过程中可能有协同作用。在人胚胎干细胞中，β-catenin可以协同Smad2/3与Oct4共同调控中内胚层分化，通过GSK3β的抑制剂CHIR99021处理，激活的Wnt信号上调了标记基因T、MIXL1和EOMES的表达，而这种表达依赖于β-catenin和Smad2的存在；同时，在中内胚层标记基因的调控区域，均能发现β-catenin和Smad2的共同结合区。当Activin/Smad信号被抑制时，β-catenin促进了神经嵴分化，进一步证明了Activin/ Smad通路与Wnt/β-catenin通路在中内胚层定向分化中的重要作用[51]。作为胚胎干细胞的重要的干性因子，Oct4在中内胚层的分化过程中也发挥了重要作用，在中内胚层标记基因的调控区域内不仅有β-catenin的结合，同样也有Oct4的富集[52]。另一项研究从新的角度同样证明了Activin和Wnt信号在调控中内胚层分化中的协同作用[53]：高浓度的Wnt3a处理人胚胎干细胞后，RNA聚合酶Ⅱ通过β-catenin/LEF-1作用聚集在中内胚层标记基因MIXL1、EOMES、NODAL等的启动子区，招募第5位丝氨酸磷酸化的RNA聚合酶Ⅱ (Ser5P-RNAPII)到标记基因的调控区，随后Activin/Smad信号协同β-catenin促进转录延伸，在Activin/Smad信号激活后，可检测到第7位丝氨酸磷酸化的RNA聚合酶Ⅱ (Ser7P-RNAPII)同样在中内胚层标记基因的调控区富集，进一步加强了转录延伸的过程。另外，Hippo信号通路的调控因子YAP同样对中内胚层的分化产生影响，在Wnt和Activin信号调控的基因中，有接近50%的基因的启动子区域内存在TEAD4的结合，敲低TEAD4、YAP或其直系同源基因TAZ会极大地促进中内胚层的分化进程。进一步研究发现，YAP协同TEAD4募集转录抑制复合物NELF (negative elongation factor)抑制Activin/Smad信号，从而维持细胞内动态平衡。因此，在中内胚层分化的早期，当Wnt/β-catenin和Activin/Smad信号增强，YAP的抑制作用被抵消，从而中内胚层基因的转录顺利进行，继而推动细胞分化。此结论支持了早期的一项研究[37]：YAP/TAZ-TEAD4同Smad2/3、Oct4形成TSO复合物，募集核小体去乙酰化复合物NuRD富集在基因的调控区域，维持干性基因的适度表达，同时抑制了中内胚层基因的转录。随着外源信号刺激的增强，Smad-FOXH1复合体破坏了原有的TSO复合体，进而通过转变基因调控区域上的复合物实现了同一信号通路在不同细胞背景下截然不同的功能。肿瘤抑制因子p53家族蛋白p53/p63/p73同样可以协同Wnt信号与Activin/Nodal信号促进中内胚层分化[54]：在分化过程中Nodal信号激活Smad2/3，而作为p53靶基因的Wnt3则激活下游Wnt信号，促进β-catenin/Tcf3协同Smad2/3结合在中内胚层标记基因Eomes、Foxa2、Gsc的增强子区域，共同促进中内胚层分化。

胚胎干细胞的分化不仅受到信号通路的精细调节，表观修饰的影响同样重要，组蛋白修饰的改变被认为是转录激活和细胞分化的先决条件之一[55]。基因组DNA的基本结构单位核小体，由4种核心组蛋白(H2A、H2B、H3、H4)各2个构成的八聚体和包裹在外部长约150 bp的DNA片段组成。4种组蛋白均包含N端柔性尾部结构，其中的赖氨酸、精氨酸、丝氨酸、苏氨酸和酪氨酸可以发生甲基化、乙酰化、泛素化或磷酸化等修饰，进而影响染色体结构和基因转录活性[56]。赖氨酸上的甲基化和乙酰化修饰对于表观调控尤为重要，其中又以组蛋白H3的研究最多。通常来说，H3K4me1、H3K4me3、H3K27ac、H3K36me3等修饰与基因的转录激活相关，而H3K9me3、H3K27me3与转录抑制相关[36, 55]。在胚胎干细胞中，大量的分化基因同时具有转录激活标记H3K4me3以及转录抑制标记H3K27me3，当受到合适的外界信号刺激时，H3K4me3与H3K27me3的平衡态受到改变，从而影响基因表达并促进胚胎干细胞向特定的命运分化。研究表明，不仅H3K4me3和H3K27me3影响细胞分化过程，H3K4ac、H3K9ac、H3K27ac、H3K4me1和H3K9me3等修饰同样也在多个发育过程中发挥重要作用，这包括中内胚层分化以及随后发生的胰腺分化、类滋养层细胞分化和神经前体细胞分化[55, 57]。在这些组蛋白修饰中，H3K4me3、H3K9ac和H3K27me3与中内胚层的分化关系最为密切[19, 55]。中内胚层标记基因T、Eomes、Sox17和Gsc等的表达受到这些组蛋白修饰的严格调控。

组蛋白甲基化在大量生物学过程中发挥重要作用，其中H3K27me3在原肠胚发育和中内胚层分化过程中主要行使转录抑制功能[58]。调控H3K27me3修饰水平的PRC2复合物(polycomb repressive complex 2)是原肠胚发育以及胚胎干细胞向中内胚层分化过程中的重要表观遗传调控分子。PRC2复合物具有组蛋白甲基转移酶活性，特异甲基化组蛋白H3上27位的赖氨酸，即H3K27me3修饰。PRC2复合物主要由EZH2、EED和SUZ12等蛋白组成，其中EZH2具有组蛋白甲基转移酶活性，SUZ12具有锌指蛋白结构域，可能参与DNA或RNA的结合，而EED具有WD40结构域，这一结构与H3K27me3的结合密切相关，通过EED与组蛋白H3K27me3的相互作用，PRC2的活性会极大增强，这种调节方式类似结合在H3K9me3上的异染色体蛋白HP1γ[59-60]。体外实验证实EZH2在行使其功能时，必须同EED、SUZ12形成复合物。PRC2复合物在早期胚胎发育中发挥重要作用，缺失EZH2的胚胎虽然能够向原肠胚分化，但无法形成原条[61]。同样，缺失EED或SUZ12也会造成原条发育障碍。与此一致，敲除EED和SUZ12的胚胎干细胞不仅会影响中内胚层的定向分化，而且会导致细胞分化的无序和杂乱[62-63]。EZH2和SUZ12在胚胎干细胞分化过程中可以调控下游重要因子的表达，这些关键的因子包括FOX家族[64]、HOX家族[59]、SOX家族以及其他例如T-box家族的TBX蛋白[65]。这些蛋白的作为转录因子，在干细胞分化过程中有放大信号的作用，对于胚胎发育至关重要。除EZH2外，其他一些甲基转移酶，如同样能够调控H3K27me3修饰的PRC1复合物成员RING1B[66]、调控H3K9me2修饰的G9A[67]以及调控H3K4me3修饰的MLL蛋白[68]，在原肠胚形成和早期胚胎发育过程中也发挥着关键作用。

由于组蛋白甲基化修饰的动态变化，因此，在中内胚层分化以及之后的中胚层和内胚层定向分化过程中，不仅EZH2等甲基转移酶有重要作用，去甲基化酶也同样重要。H3K27me3的去甲基化酶UTX (KDM6A)和JMJD3 (KDM6B)，通常与分化基因的激活有关，抑制JMJD3的活性会显著降低中内胚层标记基因的表达[69-70]。

越来越多的研究开始关注细胞命运决定过程中，信号通路如何调控染色体状态进而改变相关基因的表达。在胚胎干细胞干性维持过程中，Activin/Smad协同Nanog募集DPY30-COMPASS复合物，维持基因组特定区域H3K4me3修饰水平，当抑制Activin信号后，H3K4me3修饰水平下降，同时，干性因子的表达也出现下调，由此证明了干性维持过程中信号通路协同表观修饰发挥重要作用[71]。

除了细胞干性的维持，中内胚层的分化过程也受到外部信号通路与内部表观修饰的共同调节。我们研究发现，低浓度(25 ng/ml) Activin A和Wnt3a的协同作用可以有效诱导胚胎干细胞向中内胚层分化[21]。这一过程中，Activin A处理早期伴随着H3K27me3修饰水平的下降，这对于中内胚层的分化至关重要，而H3K4me3修饰水平则无明显变化。更进一步的实验表明，PRC2复合物中的EZH2受到Activin/Smad2的调控而下降，当敲低Smad2表达量时，H3K27me3和EZH2的水平不再发生变化。同时，在中内胚层标记基因T、MIXL1等的启动子区，H3K27me3的修饰会随着Activin A的处理而降低，但当使用小分子抑制剂SB431542阻断Activin Ⅰ型受体活性时，H3K27me3修饰水平则不随Activin信号的激活而改变。这些结果说明，Activin/Smad信号可以通过下调EZH2而有效地降低H3K27me3水平。低浓度Activin可以导致H3K27me3水平的下调，但并不能激活中内胚层标记基因的有效表达，说明需要Wnt/β-catenin协同Activin/Smad促进中内胚层分化。ChIP-assay实验证明，Smad2和β-catenin可以结合在中内胚层标记基因T、MIXL1、FGF8和NODAL的同一调控区域，而抑制Smad2后，β-catenin在这些标记基因调控区的结合会明显下降，反之亦然。由此证明了在H3K27me3修饰水平下降后，处于待激活状态的分化基因受到Smad2和β-catenin的共同调控，从而激活并促进中内胚层的分化(图 1)。

在胚胎干细胞分化至中内胚层并向内胚层发育的长时程分化过程中，H3K27me3的去甲基化酶同样发挥了重要作用，Activin和Wnt信号精细地调控了这一过程。在高浓度Activin A诱导的中内胚层分化系统中，去甲基化酶JMJD3与UTX的表达量随着分化的进行不断增高；与此一致，通过基因敲低JMJD3和UTX，分化效率明显下降，通过流式细胞仪分选得到的标记基因阳性细胞个数显著减少；激活的Wnt信号可以部分补偿JMJD3和UTX缺失导致的分化抑制，但FGF2或BMP4却无法起到这种补偿作用[69]。在胚胎干细胞中，Wnt信号靶基因的调控区域富集了大量的H3K27me3修饰，JMJD3和UTX可能调控了这些基因的激活。在中内胚层分化早期阶段，Wnt3受到JMJD3和UTX的正向调控，促进分化；在分化后期，JMJD3和UTX同样促进Wnt信号的靶基因以及同时作为其抑制因子的DKK1的表达，引导内胚层分化。因此，H3K27me3去甲基化酶JMJD3和UTX在Activin诱导下，调控Wnt信号在分化的不同阶段行使不同功能(图 2)。

除了调控表观修饰的改变之外，作为转录因子的Smad2/3和β-catenin还可以通过招募其他因子共同组成调控复合物，如Smad结合蛋白TRIM33，它包含Smad结构域和PHD-Bromo结构域，其中PHD结构域可以识别组蛋白H3K9me3修饰，而Bromo结构域则可以同H3K18ac结合。在Activin/Nodal信号激活后，Smad2/3与TRIM33形成Smad2/3-TRIM33复合物并结合在中内胚层标记基因Gsc、Mixl1的启动子区域，这一区域富集表观修饰H3K9-me3与H3K18ac，TRIM33通过Smad2/3-TRIM33复合物移除了异染色体蛋白HP1γ，从而使染色体上的Activin/Nodal信号调节区域暴露出来，随后Smad2/3-Smad4复合物募集RNA聚合酶Ⅱ，启动中内胚层标记基因的转录[72]。由此，在H3K9me3-K18ac修饰区域，不同的Smad复合物在分化过程中行使了不同的功能(图 3)。

哺乳动物胚胎发育过程中原条的形成是多种信号通路共同作用的结果，对于体外胚胎干细胞向中内胚层的分化也是这样，Activin和Wnt信号的作用尤为重要[22]。虽然目前关于中内胚层的分化已经取得了一定的认识，但对于信号通路、表观遗传修饰以及染色体活性调节之间的关系仍然需要更加深入的研究。对于信号通路的调控而言，不同的作用时间可能产生不同的调控结果，中内胚层分化这一复杂过程中信号通路的作用也常常被划分为不同阶段，而这些不同阶段中表观遗传修饰也有所不同，因此，如何证实信号通路在不同阶段中调节表观遗传修饰的改变进而影响基因表达变化和细胞分化状态，是个亟待解决的问题[21, 71]。由于胚胎干细胞在发育过程中逐渐分化出不同细胞类型，并在随后逐渐分化成为各个组织器官，因此，越来越多的研究使用单细胞测序技术来鉴定发育早期不同的细胞类群，从而探究不同类群的细胞其表观遗传修饰水平的差异以及响应信号通路的不同，这为了解分化过程不同阶段的细胞差异提供了更加有效的研究方法[23]。

作为分化过程中的过渡时期，外部信号的刺激会进一步诱导中内胚层向中胚层或内胚层分化。由于这一时期存在时间较短，目前的体外培养系统难以长期维持中内胚层的细胞状态。对中内胚层发育过程中的信号通路、表观修饰以及染色体活性调控机制的认识，不仅扩充了人们对于早期胚胎发育的理解，也加深了对细胞分化为不同器官组织的认识，也使得体外长期维持中内胚层细胞成为可能。这些工作对于深入理解中胚层和内胚层组织器官的分化发育意义重大，并有助于定向高效地诱导相关组织器官，从而为再生医学服务。