聚丙烯酰胺凝胶电泳检测非还原性SDS

一、实验简介

蛋白质的纯度鉴定可通过SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳法。利用SDS-PAGE电泳方法或毛细管电泳法（CE-SDS）提供了最简单、成本最低，并且在确定样品中蛋白质组分数目方面灵敏度最高的手段，因此最为常用。 SDS 凝胶电泳以及利用电泳测定分子质量和大小的方法 。这个方法都可以单独测定样品的纯度，方法的选择取决于希望检测待测蛋白质的何种性质。

二、基本原理

聚丙烯酰胺凝胶电泳(polyacrylamide gelelectrophoresis，PAGE)是以聚丙烯酰胺凝胶作为支持介质的一种电泳方法。聚丙烯酰胺凝胶具有机械强度好，有弹性，透明，化学性质稳定，对pH和温度变化小，没有吸附和电渗作用小的特点，是一种很好的电泳支持介质。

三、实验步骤

1、制胶：根据蛋白样品的大小制不同浓度的胶，蛋白分子量小就要制高浓度的胶，分子量大的蛋白就制低浓度的胶，制不同厚度的胶所需的浓缩胶和分离胶体积也不一样。

2、加样、电泳：过稍许时间等胶凝固后把蛋白marker和所需的鉴定的蛋白和标准品蛋白（如BSA）经处理后加到加样孔中，倒入电泳缓冲液接通电源开始跑胶。

3、染色、脱色：等示踪染料溴酚蓝跑至胶末端，关闭电源，去除浓缩胶后，将分离胶放入考马斯亮蓝染色液中染色40分钟，然后放入脱色液中脱色1小时，并换脱色液2-3次。

4、结果：根据Marker（或者蛋白标准品的相对迁移率制作的标准曲线）判断蛋白大小，根据有无杂带判定蛋白的纯度。根据BSA标准品条带的灰度制作标曲，并计算出目的蛋白的相应浓度。

四、样品要求

浓度大于0.5ug/ul,体积大于50ul, 含盐量不超过20mM

五、项目内容

序号项目明细实验选择方法备注

1还原性-SDS-PAGE检测——上样缓冲液含还原剂

2非原性-SDS-PAGE检测——上样缓冲液含不含还原剂

3还原性-CE-SDS检测关注轻重链、非糖基化重链含量比值上样缓冲液含还原剂

4非还性-CE-SDS检测关注完整的蛋白纯度上样缓冲液含不含还原剂

六、实验结果图

图 1 SDS-PAGE电泳图

图 2 毛细管电泳纯度