根系特异表达GmEXPB2启动子及不同区段的分离与应用

申请/专利权人：福建农林大学

申请日：2018-06-12

公开（公告）日：2018-11-20

公开（公告）号：CN108841824A

主分类号：C12N15/113(2010.01)I

分类号：C12N15/113(2010.01)I;C12N15/82(2006.01)I;A01H5/00(2018.01)I;A01H6/54(2018.01)I

优先权：

专利状态码：有效-授权

法律状态：2021.10.22#授权;2018.12.14#实质审查的生效;2018.11.20#公开

摘要：本发明提供了根系特异表达GmEXPB2启动子及不同区段的分离与应用，具体公开的是根系特异表达GmEXPB2启动子中低磷诱导区段的分离、鉴定及其应用，其基本序列如SEQ ID NO.1所示，本发明提供了一种低磷诱导型启动子，可利用基因工程手段来代替组成型启动子，利用遗传转化技术将其导入到植物基因组中，可实现对目标基因的定向调控。发明人的结果将为低磷胁迫生理与分子机制的理论研究及养分高效分子育种提供重要的候选基因资源，对提高作物低磷适应性的高产高效农业具有重要的指导和实践意义。

主权项：1.大豆扩张蛋白基因GmEXPB2启动子，其特征在于，所述启动子包含‑2698~ ‑1bp长度内的七个区段，其基本序列如SEQ ID NO.1所示。

全文数据：根系特异表达GmEXPB2启动子及不同区段的分离与应用技术领域[0001]本发明属于基因工程领域，具体涉及根系特异表达启动子及不同区段的分离与应用。背景技术[0002]磷是核酸和磷脂的重要组成成分，并在植物生长发育进程中参与能量代谢、酶促反应、光合作用及糖代谢等生理过程，是植物不可或缺的大量营养元素之一（Marschner，1995。然而，土壤中的磷扩散系数低，难以移动且易被土壤中的金属离子固定成为难溶态憐，因此，土壤缺憐往往是限制植物生长的主要因素之一（Raghothama，1999;Smithetal.，2003。植物在长期的进化过程中，会形成一系列适应低磷胁迫的机制。其中，根系形态构型的改变，能够影响根系与土壤养分的接触面积，进而影响根系对土壤磷的吸收Lynch,1995;BatesandLynch,2001〇[0003]植物根构型对低磷胁迫的适应性变化受到相关基因的调控（Niuetal.，2〇13。随着植物基因组测序的完成，结合现代分子生物学技术手段，一些参与调控根构型及低磷响应的关键基因被克隆和分析。PTF是一类编码bHLH类蛋白的转录因子。低磷胁迫能够诱导水稻OsPTFl及玉米ZmPTFl基因在根部中的表达，且在水稻和玉米中分别过量表达这两个基因均能促进根系发育，增加根系干重及生物量，从而提高磷效率（Yietal.，2005;Lietal.，2011。在大豆中，利用低磷诱导、根系特异的缩减杂交文库，克隆了一个细胞壁扩张蛋白，，该基因，主要受低磷诱导，在根系中高度表达。利用异源转化拟南芥及大豆整株转化的功能研究发现，过量表达均能促进拟南芥及大豆的主根和侧根发育，提高磷效率而增加植株生物量（Guoetal.，2008;Guoetal.,2011;Zhouetal.，2014。此外，最新研究也表明，GmEXPB2通过改变根构型，增加根毛数目而增加根瘤菌与根系的接触面积，进一步促进了高、低磷条件下的大豆结瘤（Lietal.，2015。所以，GmEXPB2通过改变根形态构型及细胞发育进程，协同调控了大豆氮、磷效率。[0004]综上可知，根系特异的基因受低磷调控，在提高大豆氮、磷营养效率方面起着重要作用。然而，关于其受低磷调控机制还未见报道。启动子能控制基因表达的起始时间和表达的程度，包含核心启动子区域和调控区域，就像“开关”，决定基因的活动。在未来植物基因工程研究中，为更有效的发挥外源基因作用同时避免其对不同组织及环境产生副作用，研究组织特异性表达和诱导型启动子己成为现代分子生物学研宄的热点之一。因此，挖掘GHEXPB2的启动子区段及其对低磷的表达响应，对解析植株适应低磷胁迫的调控机理具有重要意义。同时，为植物通过改变根构型提高低磷适应性的研究提供可应用的启动子参考序列，以及为创建磷高效新材料提供理论依据。发明内容[0005]基于上述研究背景，本发明提供了根系特异表达启动子及不同区段的分离与应用，通过对大豆扩张蛋白基因启动子区段化并构建双元表达载体，利用转基因复合植株分析在高、低磷条件下不同区段启动子的表达。[0006]为实现上述目的，本发明采用以下技术方案：大豆扩张蛋白基因启动子，包含-2698〜-lbp长度内的七个区段，其基本序列如SEQIDN0.1所示。[0007]所述的启动子，还包括具有大豆启动子_2698〜-lbp区段间任何长度核苷酸序列的启动子。[0008]所述启动子包含七个区段，-304〜-lbp区段序列如SEQIDN0.2所示；_465~-1匕口区段序列如3£〇1〇勵.3所示，-687~-15口区段序列如3£〇1〇从_4所示；-9〇7~-让0区段序列如SEQIDN0.5所示，-1401〜-lbp区段序列如SEQIDN0.6所示，-I7"〜_lbp区段序列如3£〇10从.7所示，和-2698〜-11?区段序列如3£〇10奶.1。[0009]还包括七段任一核苷酸序列或其截短的功能等同物或变异体或以任何组合方式包括，置换、加入、重复和缺失形成的、或与其他启动子连接形成的融合启动子。[0010]一种植物表达载体，它含所述启动子不同区段的序列。其包括重组转化所形成的转基因植物，以及由此产生的外源基因表达产物。所述的植物，包括由转基因作物亲本杂交或转育所产生的植物。[0011]所述的大豆扩张蛋白基因GfflEWWP启动子在豆科作物对低磷适应性的研究及作物氮、磷养分高效的分子育种中的应用。[0012]研宄结果表明，ATG起始密码子上游-2698bp在内的七个区段均能驱动GUS基因的表达;-304bp〜-1bp和-465bp〜-1bp区段在根系中受低磷诱导表达，而在根瘤中受低磷增强表达，两区段内含有低磷响应的增强子;而其他五个区段与CaMV35S具有相近的表达量。[0013]本发明的有益之处在于:此项研宄分离鉴定了受低磷诱导根系特异的启动子区段，对解析通过根构型改变适应低磷胁迫的分子机理具有重要意义，为植物提高低磷适应性的研究提供可应用的启动子参考序列，以及为创建磷高效新材料提供理论依据。本发明为包括大豆在内的豆科作物对低磷适应性的研究及作物氮、磷养分高效的分子育种提供更佳的启动子区段。附图说明[0014]图似启动子区段示意图;启动子扩增长度分为ATG起上游-304bp，-465bp，-687bp，-907bp，-1401bp，-1799bp和-2698bp，并分别用2-1、2-2、2-3、2_4、2-5、2-6和2-7表不。[0015]图2为启动子不同区段PCR检测。[0016]图3为PTF102载体示意图。[0017]图4为不同启动子驱动GUS染色情况。[0018]图5为GtS基因相对表达量。[0019]图6为伽£1邵2不同区段启动子驱动GUS在根系及根瘤中的染色情况。具体实施方式[0020]以下结合附图和具体实施例对本发明作具体的介绍。[0021]实施例启动子区段扩增及载体构建本发明利用大豆Wi11imas82叶片DNA模板，从其基因组中分离获得了从ATG起始的上游2698bp表达启动子序列SEQIDN0.1。具体操作为：以启动子特异引物扩增其启动子2698bp片段，PCR反应体系为50此，包含10yM正反向引物各1yL，10XPCRbuffer5yL，2_5mMdNTP8yL，Taq酶0.3uL，基因组DNA模板量1yL，然后用灭菌ddH20补足50uL。[0022]PCR反应程序为：94°C2分钟；94°C30秒，53°C30秒，72°C3分钟，扩增30个循环;72°C延伸10分钟。扩增的PCR产物通过1%琼脂糖胶电泳，通过Goldenview核酸染料染色后，在凝胶成像系统成像。[0023]PCR产物纯化:DNA凝胶回收试剂盒回收PCR产物。[0024]载体的连接:将PCR产物与T载体连接后，转化大肠杆菌测序无误后待用。其中，分离启动子序列所用的引物为：pGmEXPB2F:5’-TAGCTGCAATTGGATAGAA-3，（SEQIDN0:8pGmEXPB2R:5’-MTATCACAACCTCTAGGAT-3’（SEQIDN0:9进一步将其分成七段，分别命名为2-15£〇10购:2、2-28£〇10队:3、2-38£〇10NO:4、2-4SEQIDNO:5、2-5SEQIDNO:6、2-6SEQIDNO:7和2-7SEQIDNO:1并设计特异引物进行PCR扩增，利用和£c〇y?I对目的载体pTF102进行双酶切，用于置换CaMV35S，通过重组酶连接，转化大肠杆菌，单克隆测序无误后，抽质粒转化发根农杆菌K599备用。其中，七段启动子共用后引物，引物序列为：proGmEXPB2R:5’-GACTGACCTACCCGGggatccAATATCACAACCTCTAGGAT-3’（SEQIDN0:102-1基因前引物为：pro2-lF:5'-CTATGACATGATTACgaattcAGGGGATATCTTTACAATAC-3，SEQIDNO:112-2基因前引物为：pro2-1F:5’-CTATGACATGATTACgaattcTTTAAAAAGCTTGAGCTTG-3’（SEQIDN0:122-3基因前引物为：pro2-3F:5’-CTATGACATGATTACgaattcGGATAAGATAAGATGAGATGA-3，（SEQIDN0:132-4基因前引物为：pro2-4F:5’-CTATGACATGATTACgaattcCGTATAAGTAATGTACAAATCC-3’（SEQIDNO:142-5基因前引物为：pro2-5F:5’-CTATGACATGATTACgaattcATCATAAAATATTTGAGTGTCTA-3’（SEQIDNO:152-6基因前引物为：pro2-6F:5!-CTATGACATGATTACgaattcAAAGCATAATTCCCTGTTC-3，SEQIDNO:162-7基因前引物为：pro2-7F:5’-CTATGACATGATTACgaattcTAGCTGCAATTGGATAGAA-3，（SEQIDN0:17结果表明（见图1-3:如示意图1所示，PCR扩增启动子共七段，并回收PCR产物参见图2，利用£c〇i?I和BanI分别构建不同区段的双元表达载体PTF102图3，转化K599,用于后续GUS染色及表达检测。[0025]实施例2、高、低磷条件下不同区段启动子驱动GUS表达情况大豆种子Willimas82种子在12全营养液润湿的石英砂中催芽萌发砧，利用1mL注射器在下胚轴处划出伤口并分别涂抹内含不同区段启动子质粒的农杆菌K599，侵染植株并获得毛状根。待毛状根长至4-5cm，切去主根保留毛状根，根系经GUS检测后，获得阳性转基因毛状根。复合植株恢复3d后，进行高磷（HP:500yMKH2P04和低磷（LP:5yMKH2P〇4水培营养液中处理14d。收获根系进行GUS染色和定量PCR分析。对于GUS染色，将根系用磷酸缓冲液润洗，并浸泡至⑶S染色液中，37°C恒温反应12h，而后75%酒精脱色，并拍照。对于GtS表达量分析，收获根系并抽提RNA，反转录成cDNA，进一步用定量PCR检测G仍基因的表达量。大豆的看家基因作为内参。用于定量PCR检测基因表达量的引物分别为：大_S_£F-Za基因的引物为：EF-laF:5’-TGCAAAGGAGGCTGCTAACT-3’（SEQIDN0:18EF-laR:5’-CAGCATCACCGTTCTTCAAA-3’（SEQIDN0:19GtS基因的引物为：GUS-qF:5’-GTCCTGTAGAMCCCCAACC-3’（SEQIDN0:20JUS-qR:5’-CTGCATCGGCGMCTGATC-3’（SEQIDN0:21定量PCR反应程序为:将RNA反转录所得的cDNA稀释30倍作为定量PCR反应模板。试验中米用20nL反应体系，包括：10uL的StartTopGreenqPCRSuperMixTrans，各0.6uL的10yM正反向引物，2uL稀释的cDNA，最后Mili-Q水补至20yL。[0026]定量PCR反应条件为:定量PCR反应条件为:95°C变性1min，然后94°C裂解15s，60°C结合15s，72°C延伸30s并进行40次循环。[0027]相对表达量是的表达与大豆看家基因表达的比值。计算采用方法。[0028]图4-5为高、低磷条件下不同区段启动子驱动GUS的表达情况。其中：图4为Gn欣不同启动子驱动GUS染色情况；图5为GUS基因相对表达量。[0029]试验数据是三个生物学重复的平均值和标准误。[0030]星号表示转基因和野生型大豆同一性状之间的显著性差异：*表示显著水平〇•01p0.05时，差异显著；**表示显著水平0.001p〇.〇1时，差异显著性介于显著与极显著之间。[0031]结果表明：2-1-304bp〜-1bp和2-2-465bp〜-1bp区段在根系中低磷条件下GUS染色较深，而在高磷条件下，GUS染色较浅，说明，2-1和2-2区段受低磷诱导表达;而其他区段在高低、磷条件下，差异不明显，且与强启动子驱动GUS染色相似，参见图LGtS基因表达结果与GUS染色结果相吻合，2-1和2_2区段在LP条件下驱动GUS的表达量显著高于HP处理，而其他区段驱动GUS的表达量在高、低磷条件下没有明显差异且达到CaMV35S强启动子驱动GUS的表达量，参见图5。说明，2-1-304bp〜-1bp和2-2-465bp〜-1bp区段含有低磷响应的增强子，同时，似启动子驱动基因表达能够达到CaMV35S强启动子的效果。[0032]实施例3、Gn£IP52不同区段启动子驱动GUS在根系及根瘤中的染色情况前期研宄发现，GmEXPB2通过改变根构型及促进细胞发育而参与大豆结瘤过程（Lietal.，2015。为了进一步分析启动子区段在根瘤中驱动GUS表达情况及对高、低磷处理的响应，2-1、2-2、2_3和2-4区段被筛选用于结瘤试验。将阳性转基因毛状根浸泡在根瘤菌菌液中1h，并移入砂:蛭石等质量比例混合的花盆中，隔天浇低氮LN:530uM[NH4N03+NH42S04+KN03+CaN032.4H20]、高磷（HP:500yMKH2P〇4或低磷（LP:5yMKH2P04营养液处理14d。收获根系及根瘤进行GUS染色。将收获样品用磷酸缓冲液润洗，并浸泡至⑶S染色液中，37°C恒温反应12h，而后75%酒精脱色，并拍照。结果见图6。[0033]NH4N03+NH42S〇4+KN〇3+CaN〇32•4H20中三种氮源总量是530ym;包括硝酸钾0.15mM、硝酸钙0.12mM、硝酸铵0.04mM、硫酸铵0.03mM。[0034]图6为不同区段启动子驱动⑶S在根系及根瘤中的染色情况。[0035]结果表明：2-1-304bp〜-1bp和2-2-465bp〜-1bp区段在根瘤中受低磷的增强表达。高磷（HP条件下，两区段在根系中几乎检测不到GUS染色，而在根瘤中具有相对较深的⑶S活性;在低磷条件下，2-1、2_2、2-3和2-4四个区段均能驱动GUS在根系和根瘤中表达，并且2-3和2-4区段在根系和根瘤中表达相近，不受磷的调控。[0036]综上所述，扩张蛋白基因似不同区段的启动子，均能驱动GUS报告基因的表达;-304〜-1bp和-465〜-1bp两区段启动子受低磷诱导，且表达量能达到CaMV35S强启动子驱动GUS的表达效果，说明此区间内存在低磷响应元件的增强子。此项研究分离鉴定了受低磷诱导根系特异的启动子区段，为植物提高低磷适应性的研宄提供可应用的启动子参考序列，以及为创建磷高效新材料提供理论依据。[0037]需要说明的是，上述实施例不以任何形式限制本发明，凡采用等同替换或等效变换的方式所获得的技术方案，均落在本发明的保护范围内。

权利要求：1.大豆扩张蛋白基因启动子，其特征在于，所述启动子包含-2698〜-lbp长度内的七个区段，其基本序列如SEQIDNO.1所示。2.根据权利要求1所述的启动子，其特征在于，包括具有大豆启动子-2698〜_lbp区段间任何长度核苷酸序列的启动子。3.根据权利要求1所述的启动子，其特征在于，所述启动子包含七个区段，-304〜-lbp区段序列如SEQIDN0.2所示;-465〜-lbp区段序列如SEQIDN0.3所示，-687〜-lbp区段序列如SEQIDNO.4所示;-907〜-lbp区段序列如SEQIDN0.5所示，-1401〜-lbp区段序列如SEQIDNO.6所不，-1799〜-lbp区段序列如SEQIDN0_7所不，和-2698〜-lbp区段序列如SEQIDN0.1。4.根据权利要求2所述的启动子，其特征在于，包括七段任一核苷酸序列或其截短的功能等同物或变异体或以任何组合方式包括，置换、加入、重复和缺失形成的、或与其他启动子连接形成的融合启动子。5.—种植物表达载体，其特征在于，它含有权利要求1所述启动子不同区段的序列。6.根据权利要求5所述的表达载体，其特征在于，包括重组转化所形成的转基因植物，以及由此产生的外源基因表达产物。7.根据权利要求5所述的表达载体，其特征在于，所述的植物，包括由转基因作物亲本杂交或转育所产生的植物。8.如权利要求1所述的大扩张蛋白基因'沿切2启动子在豆科作物对低磷适应性的研宄及作物氮、磷养分高效的分子育种中的应用。

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