新型冠状病毒的检测方法与原理

        2020年因新型冠状病毒而显得异常魔幻，一个我们看不见也摸不到的“小家伙”，把这个世界彻底给搅乱了，如何“看”到它也就成了战胜它的重要前提。今天，我们将从核酸检测和蛋白检测两个方面给大家介绍新型冠状病毒的检测方法和原理，了解人类狙击病毒的“前哨站”。

        新型冠状病毒属于冠状病毒家族。从系统分类来看，属于套式病毒目（Nidovirales）；冠状病毒科（Coronaviridae）；冠状病毒属（Coronavirus）。它具有囊膜外壳，和单股正链RNA的基因组。冠状病毒只感染脊椎动物，目前发现的能感染人的冠状病毒有7中，其中包括2003年的SARS-CoV，2012年的MERS-CoV和当前的新型冠状病毒。2020年1月12日，WHO将其命名为新型冠状病毒：2019 Novel Coronavirus （2019-nCoV）；2月11日，国际病毒分类委员会将其命名月SARS-CoV-2（严重急性呼吸综合征（SARS）冠状病毒2号，SevereAcute Respiratory Syndrome Coronavirus 2）（图1）。

        2020年2月7日，中国将新冠病毒感染的疾病称为新型冠状病毒肺炎，“Novel Coronavirus Pneumonia”，简称“NCP”。2020年2月11日，WHO将其称为新型冠状病毒疾病：Coronavirus Disease 2019，简称COVID-19。COVID-19的临床症状有发热、乏力、呼吸困难等；根据病人影像学尤其是解剖学的分析，COVID-19能造成包括肺，肝脏等在内的多器官损失。

        新冠疾病作为一种高传染性疾病，对其病原体的检测是诊疗病人的关键。目前检测传染病的策略包括两点，检测病原体本身，或检测人体为了抵抗病原体而产生的抗体，也就是病原学检测和血清学检测。例如，在冠状病毒中，针对其刺突糖蛋白，包膜蛋白和核衣壳蛋白的检测，就属于病原学检测中的抗原检测；而针对其基因组RNA的检测则是病原学中的核酸检测。病毒入侵人体，一般会激活机体的特异性免疫，产生抗体进行抵御，针对这些特异抗体的检测则属于血清学检测。

        这里我们从分子生物学的角度，将上述检测类型重新分成核酸检测和蛋白检测（表1）。不过这里要注意的是，抗原不一定都是抗体，细菌上的脂多糖LPS就不是蛋白。检测方法上，我们将介绍qPCR、等温扩增和基于CRISPR的三种核酸检测技术。蛋白检测方面则主要讲解胶体金法抗体检测。

        目前针对新型冠状病毒的检测主要是采用的是qPCR (Real time quantitative PCR, 实时荧光定量PCR）中的Taqman水解探针法。2020年1月21日，中国疾控中心提供的用于新型冠状病毒核酸检测的引物和探针序列（图3）。

        在正式介绍实时荧光定量PCR之前，我们先介绍以下PCR原理。PCR （Polymerase Chain Reaction），即聚合酶链式反应，是一种以指数级方式扩增核酸分子的技术（图4）。一个PCR反应，使用的材料包括：DNA聚合酶，dNTPs，合适的缓冲液，引物以及DNA模板。混合好的PCR反应体系，在热循环仪中进行多循环的变性，退火和延伸，即可进行DNA的扩增。在变性阶段，高温将DNA双链打开，然后降温到退火温度，引物与DNA互补配对，DNA聚合酶催化新链延伸合成，此为一个循环；然后再进行变性，退火，延伸。理论上PCR产物理论上以2N(N是循环数)方式增长。

        实时荧光定量PCR，是基于荧光物质实时检测DNA含量的方法。目前主要有使用SYBR Green等的嵌合荧光检测法和Taqman水解探针法两种。

        在嵌合法中使用的SYBR Green I是一种结合于所有dsDNA双螺旋小沟区域的具有绿色激发波长的染料。在游离状态下，SYBR Green I发出微弱的荧光，但一旦与双链DNA结合后，荧光大大增强。SYBR Green I的荧光信号强度与双链DNA的数量相关，检测荧光强度即可反应dsDNA数量。

        Taqman水解探针法则使用了三条引物，除正常PCR的正反向引物外，还有一条带荧光标记的探针，其5’端带有荧光物质（如：FAM等），3’端带有淬灭物质（如：TAMRA等）修饰，在探针完整的情况下，由于淬灭基团的存着，荧光物质并不发射荧光。而延伸阶段，TaqDNA 聚合酶的5’-3’核酸外切酶活性可以分解与模板杂交的荧光探针，游离荧光物质发出荧光。通过检测反应体系中的荧光强度，可以达到检测PCR 产物扩增量的目的。

        PCR 产物理论上以2N(N是循环数)方式增长，但实际上，由于酶活、原料消耗等，PCR产物逐渐趋于不变（图6）。

         下面我们介绍qPCR中的“四线三值”。四线：扩增曲线、基线、标准曲线和熔解曲线；三值：阈值、Ct值和Tm值。

        扩增曲线是指以循环数为横坐标，荧光强度为纵坐标所作曲线。PCR初始数个循环（通常3-15）的荧光信号，基本不变，接近一条直线，即为基线；实际应用中，基线的取值范围是可以手动设置的。阈值的默认设置是3-15个循环的荧光信号的标准偏差的10倍，也可手动设置。Ct值则是指荧光信号达到设定阈值时的循环数。

        如图8左所示，使用不同量的DNA作为模板进行qPCR，就可以检测到每一个量下的Ct值，然后以模板DNA量为横坐标，所对应Ct值为纵坐标绘制的直线，即为标准曲线。根据这个曲线，我们就可以计算任何Ct值情况下对应的模板量，即可以进行绝对定量。当然，有些时候绘制出来的并不是一条曲线，这可能暗示，所用的引物的扩增效率并不是100%。因此，标准曲线主要用于评估引物的扩增效率和进行绝对定量分析。

        接下来，介绍的是溶解曲线和Tm值。其中熔解曲线是指随温度升高DNA的双螺旋结构降解程度的曲线；Tm值则表示总的DNA双螺旋结构降解一半的温度。理想情况下，我们针对某一个基因设计的引物，这个引物应该就会很特异；但实际情况却是，PCR过程中很容易出现没特异扩增，这样会造成定量上的不准确。例如图9中，从扩增曲线图中，两对引物的扩增曲线都很正常，但在溶解曲线分析过程中就发现其中一条曲线异常，存在双峰形式，这提示这一对引物的扩增产物可能有两种不同大小的片段。

        前面介绍了SYBR和Taqman两种qPCR方法，我们小结一下（表2）。

        我们重新再回到新型冠状病毒的检测方法。目前主要是基于荧光探针法，即Taqman的方法。基本流程就是，采集病人的咽拭子、鼻拭子等，然后进行病毒灭活，降低感染风险，再进行RNA提取、逆转录和qPCR检测，根据检测结果判定感染情况（图10）。

        当然，在新型冠状病毒的检测过程中，出现了较高的假阴性率，这其中的影响因素很多，例如病毒变异，样品收集处理、试剂耗材质量等等。因此，现在一般是进行至少两次检测，以判断感染情况。

        目前，对于新型冠状病毒的检测主要是基于Taqman方法进行，一些研究团队也报道了其他的检测方法，例如基于等温扩增检测。

        所谓的等温扩增就是恒定温度下的核酸体外扩增技术。而前面提到的PCR，则是热循环核酸体温扩增技术。等温扩增对仪器设备的要求低，用恒温水浴就可以进行，并且反应时间短。目前等温扩增技术有很多种，例如环介导等温扩增 (Loop-mediated isothermal amplification, LAMP)，  依赖核酸序列的扩增(Nucleic acid sequence-based amplification，NASBA)，  滚环扩增技术(Rolling circle amplification，RCA)，  单引物等温扩增技术(Single primer isothermal amplification，SPIA)，  依赖解旋酶DNA等温扩增技术(Helicase-dependent isothermal DNA amplification，HDA)，  重组酶聚合酶扩增(Recombinase Polymerase Amplification，RPA)，  链替代扩增(Strand displacement amplification，SDA)等。

         这里我们主要介绍其中的环介导等温扩增。这种方法中最关键的是引物设计和具备高链置换活性的DNA聚合酶。所谓的链置换活性，就是指双链DNA中，新链合成的同时将原来的原来的链替换下来。

        LAMP的反应体系与PCR类似，也需要dNTPs，DNA模板，引物等，不过只需要恒定温度，如65摄氏度，不需要热循环。对于以RNA为起始的LAMP，则需要先进行逆转录合成cDNA。

        因此，进行新型冠状病毒的LAMP检测，同样需要进行样品收集，病毒灭活，核酸提取以及扩增等步骤。那么扩增出来的产物又如何监测呢，目前有多种方法进行检测。

        首先，我们介绍浊度法，就是观察反应也混浊度的变化。如果反应体系中出行了扩增，dNTPs就会参入新合成的DNA中，释放出焦磷酸，而溶液中的Mg2+则可以和焦磷酸反应，产生白色沉淀。如果反应体系中没有发生扩增，也就不会出行白色沉淀。

        颜色变化也是LAMP检测的常用方法，例如金属离子指示剂——羟基萘酚蓝（HNB）。在没有扩增的情况下，HNB与Mg2+结合，呈现紫罗兰色；而如果出行扩增，Mg2+因为和焦磷酸反应而与HNB剥离，HNB呈现天蓝色。

        另外还有应用荧光的检测方法，例如橙绿变色染料（OG Dye）可与LAMP扩增产物结合成明显的肉眼可见的荧光绿色，阴性反应则为橙色。

        由于在LAMP扩增中用到很高浓度的引物，因此难免保证有少量错配和引物二聚体，这些轻微的污染都会导致LAMP高速的扩增中造成假阳性检测。将LAMP与高特异性的Taqman联合，提高LAMP的检测特异性。

        在medRxiv和bioRxiv上已经有了基于CRISPR/Cas检测新型冠状病毒的报道[4]。目前最为人所知的是CRISPR/Cas9，它可以进行基因编辑。而随着研究的深入，CRISPR/Cas系统越来越多样，开发出来靶向双链DNA的CRISPR/Cas12a[5]和靶向RNA的CRISPR/Cas13[6]，这也是目前在核酸检测中应用最多的系统。

        其中，张峰等使用CRISPR-Cas13系统开发了SHERLOCK核酸检测系统，其原理是CRISPR-Cas13a-sgRNA与靶基因（RNA）结合，激活Cas13a的RNase活性[7]；Doudna, J.等则基于CRISPR-Cas12a (Cpf1)-sgRNA与靶基因（DNA）结合，激活Cas12a的ssDNase活性，开发了DETECTR核酸检测系统[5]。在反应体系中存在sgRNA的靶向DNA或RNA时，可以激活Cas的核酸酶活性，通过降解标记的探针，可以实现对目标核酸的检测。目前有荧光检测和侧向流检测试纸两种形式进行核酸检测的可视化。

        在侧向流检测试纸中，使用的是带生物素和荧光基团的标记探针，一旦探针被降解，荧光集团和生物素就会分开，通过试纸可以检测到两条信号带。荧光检测则使用了类似Taqman方法中的荧光基团和淬灭基团标记的探针，在探针被降解后，荧光基团和淬灭基团分离，荧光基团的荧光得到恢复，通过仪器可进行检测。右图，是张峰实验室基于SHERLOCK开发的用于检测新型冠状病毒的技术[8]。

4. 蛋白检测

        目前应用到临床的核酸检测方法主要是Taqman实时荧光定量PCR，此外，还有针对抗体IgM和IgG的蛋白检测方法。接下来，我们简单介绍相关的蛋检测技术。

        首先，我们了解一下免疫、抗原和抗体的相关概念。免疫是机体识别“自己”和“非己”，维持机体稳态的一种生理机制；包括先天性免疫；特异性免疫（体液免疫与细胞免疫）。抗原则是刺激机体产生免疫反应的异己物质；如病毒，外毒素，癌细胞等。抗体（antibody）机体由于抗原的刺激而产生的具有保护作用的蛋白质，包括IgG、IgM、IgA、IgE和IgD五种类型; SASR-CoV-2入侵人体后，在细胞中不断复制积累，可以通过检测病毒表明特征蛋白表征病毒感染情况；同时，入侵的病毒激活机体特异性免疫，产生IgM和IgG等抗体进行病毒清除。

        我们最常说的抗体就是IgG，类似于一种“Y”型结构，由两条重链和两条轻链组成。在N端有识别抗原表位的超变区，C端为不变区（Fc）。基于抗体与抗原的特异性识别反应，目前已经开放了一系列免疫检测方法，最常见的如Western blot；临床上则多采用胶体金检测试纸。目前已经有针对新型冠状病毒特异IgM和IgG的检测试纸，用于进一步确认病人的感染情况。

        我们先介绍Western blot。图示是蛋白质免疫印迹技术的常规流程。我们收集的蛋白质样品，通过凝胶进行分离后，将凝胶上带负电蛋白转移至带正电的膜上，然后对膜进行封闭处理，再与和目的蛋白质特异结合的抗体进行孵育，这时候抗体会结合在膜上特定的位置，通过一抗与标记抗体（二抗）结合实现对目标蛋白的可视化。 

        接下来，我们重点介绍针对新型冠状病毒的IgM/IgG的检测方法。在新型冠状病毒感染之后，人体会产生两种不同的特异性抗体：一种是感染后快速产生的IgM抗体，可作为早期感染指标；另一种是IgG抗体，产生较晚、但维持时间长，在康复期甚至疾病痊愈后都可以被检测到，是感染和既往感染的重要指标。

        我们以IgM为例介绍胶体金试纸的原理。这种试纸包括五个功能块，分别是样品垫（加样区），结合垫（含有胶体金标记的抗原），检测线（还有识别IgM的抗体），质控线（含有抗原特异性识别抗体，类似阳性对照），吸水垫（提供样品的流向动力）。样品加在样品垫上后，样品逐渐往吸水垫方向流动，在结合垫位置，如果样品中有特异识别抗原的IgM，就会结合带胶体金标记的抗原继续往检测线方向流动，在检测线的位置，由于有固定着的识别IgM的抗体，会将低金标抗原-IgM的复合物固定下来，显示一条“红线”。而多余的金标抗原则会继续流动到质控线，被抗原特异的识别抗体结合固定在质控线位置，显示“红线”。

        因此，如果病人被新型冠状病毒感染，会在质控线和检测线两个位置出现“红线”，否则为阴性或者无效结果。这种检测方式一般只需要15min。

        最后，我们总结一下核酸检测和蛋白检测。在特异性方面核酸检测更高，但相应的时间也会比较长。此外，核酸检测可以在感染的各个时期进行检测，但蛋白的检测则比较有局限性，要在感染7天后或是出现症状3-4天才能比较准确的反映感染情况。两种检测方法，在样品制备、样品类型、设备要求以及专业要求和成本上也存在着差异。目前针对新型冠状病毒的检测以核酸检测为主，辅以蛋白检测。

参考文献

1.  Heid, C.A., et al.,Real time quantitative PCR.Genome Res,1996.6(10): p. 986-94.

2.  Yu, L., et al.,Rapid colorimetric detection of COVID-19 coronavirus using a reverse tran-scriptional loop-mediated isothermal amplification (RT-LAMP) diagnostic plat-form: iLACO.medRxiv, 2020: p.2020.02.20.20025874.

3.  Lamb, L.E., etal.,Rapid Detection of Novel Coronavirus (COVID-19) by Reverse Transcription-Loop-Mediated Isothermal Amplification.medRxiv, 2020: p. 2020.02.19.20025155.

4.  Broughton, J.P.,et al.,Rapid Detection of 2019 Novel Coronavirus SARS-CoV-2 Using a CRISPR-based DETECTR Lateral Flow Assay.medRxiv, 2020: p. 2020.03.06.20032334.

5.  Chen, J.S., etal.,CRISPR-Cas12a target binding unleashes indiscriminate single-stranded DNase activity.Science, 2018.360(6387): p. 436-439.

6. Abudayyeh, O.O.,et al.,C2c2 is a single-component programmable RNA-guided RNA-targeting CRISPR effector.Science, 2016.353(6299): p. aaf5573.

7.  Gootenberg,J.S., et al.,Nucleic acid detection with CRISPR-Cas13a/C2c2.Science, 2017.356(6336):p. 438-442.

8.  Kellner, M.J.,et al.,SHERLOCK: nucleic acid detection with CRISPR nucleases.Nat Protoc, 2019.14(10): p. 2986-3012.

9.  Zhang, F., O.O.Abudayyeh, and J.S. Gootenberg,A protocol for detection of COVID-19 using CRISPR diagnostics.2020.