衰老相关分泌表型的作用机制及相关药物研究进展

中国是世界上老年人口数量最多的国家, 且老龄化程度日益加深, 给社会造成了沉重的负担。如何延长寿命, 并提高老年人的生活质量, 是当前研究的热点。

细胞衰老由Hayflick & Moorhead于1961年首次提出, 最初用来描述衰老的成纤维细胞在适宜的生长条件下丧失复制能力, 进入永久的生长周期停滞状态[1], 分为增殖衰老和早熟衰老两种类型。除此之外, 细胞的另一个典型特征是分泌SASP。SASP由Coppe等[2]于2008年首次提出, 是衰老细胞分泌的细胞因子的总称, 可通过自分泌和旁分泌途径诱发机体炎症, 并向邻近细胞传递衰老信号, 通过组织微环境和ROS介导的途径, 加剧端粒功能障碍, 加速细胞衰老[3]。

根据细胞种类, 以及引起细胞衰老的刺激方式不同, 细胞可分泌不同类型的SASP。基于启动SASP活性的作用方式不同[4], 可将SASP分为3种类型: ①受体需要型:促炎因子:白介素-1α (interleukin-1α, IL-1α)、白介素-1β (interleukin-1β, IL-1β)、白介素-6 (interleukin-6, IL-6)、白介素-8 (interleukin-8, IL-8)等, 趋化因子-1 (chemokine-1, CXCL-1)、趋化因子-3 (chemokine-3, CXCL-3)、趋化因子-10 (chemokine-10, CXCL-10)等, 生长因子:肝细胞生长因子(hepatocyte growth factor, HGF)、转化生长因子-β (transforming growth factor-β, TGF-β)、粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(granulocytemacrophage colony stimulating factor, GM-CSF)等; ②直接反应型:金属蛋白酶(matrix metalloproteinases, MMPs)、丝氨酸蛋白酶、活性氧(reactive oxygen species, ROS)、代谢物、转运离子等; ③调节型:金属蛋白酶的组织抑制剂(tissue inhibitors of metalloproteinases, TIMPs)、纤溶酶原激活物抑制剂(plasminogen activator inhibitor, PAIs)和胰岛素样生长因子结合蛋白(insulin-like growth factor-binding proteins, IGFBPs)等。此外, 小的胞外囊泡(small extracellular vesicles, sEVs)及其miRNA可作为SASP的新成员[5], 被称为“EV-SASP”, 在细胞状态改变或受到外界刺激时产生并分泌, 以类似于激素或细胞因子的方式, 参与细胞间通讯, 并维持衰老细胞的抗凋亡活性[6]。

SASP是一柄双刃剑[7], 在正常细胞中能正向调节免疫反应、细胞生长抑制或细胞分化; 而在人类恶性肿瘤中, 能促进肿瘤迁移、增殖、侵袭和血管生成, 最终导致肿瘤转移。事实上, SASP的促炎作用是机体正常修复反应的一部分, 能保护人体免受细菌和病毒感染及有害环境因素的影响[8], 具有激活免疫系统、促进伤口愈合[9]、促进胚胎发育等重要作用, 因而在进化中被保留下来; 但是, 随着年龄增长, 在机体免疫功能下降、自噬失调、端粒缺失等多种因素影响下[10], 衰老细胞在体内大量积累, 导致炎症因子水平增加, 促进疾病发生[11]。因此, 衰老细胞分泌的SASP是机体衰老的重要指标, 也是多种年龄相关疾病的诱发因素[12]。

随着年龄增长, 多种刺激导致DNA损伤不断积累[13], 造成DNA过度损伤, 不仅会破坏端粒, 还会导致持续的DNA损伤反应(DNA damage response, DDR), 进而引起衰老[14]。在细胞衰老进程中, SASP的分泌是一个动态过程, 可分为以下三个阶段:第一阶段在DNA损伤后立即开始, 并持续36 h, 但不足以导致衰老; 第二阶段是“早期”SASP的形成, 在诱发细胞衰老后数天, 开始出现最重要的SASP因子, 例如IL-1α; 第三阶段是“成熟”SASP的形成, 在接下来的4~10天内, 通过正反馈回路对转录进行调控, 使大多数因子的分泌增加, 最终形成“成熟”的SASP[15]。

在多种衰老模型中, 如: SAMP8快速老化小鼠[16]、D-半乳糖诱导的衰老大鼠[17]、衰老果蝇、衰老线虫[18]、百草枯诱导的衰老星形胶质细胞[19]、自然衰老的胎盘细胞[20]、MDM2抑制剂诱导人成纤维细胞衰老模型[21], 均表现出SASP因子大量分泌, 主要是IL-1α、IL-1β、IL-6和肿瘤坏死因子-α (tumornecrosisfactor-α, TNF-α)等, 其中IL-1α是其他SASP的上游调节因子。

在正常细胞中, SASP基因通常被高度抑制, 以防止炎症信号的不恰当表达, 然而在衰老细胞中, SASP基因却高度表达。事实上, SASP的表达进程很慢, 在DNA损伤诱导的衰老成纤维细胞中需要一周时间才能达到峰值。SASP基因的延迟表达, 有助于免疫系统及时清除衰老细胞[22], 并进行DNA损伤修复[23]。与此同时, 衰老细胞通过分泌SASP因子向邻近细胞传递衰老信号, 分泌到周围环境中的SASP, 通过阻断细胞的分化, 阻止受损细胞的更新, 干扰组织的年轻化, 进一步加速衰老[24]。

DDR是SASP的重要驱动因素, 它的启动依赖于两种主要激酶系统(ataxia-telangiectasia mutated, ATM和ataxia-telangiectasia and Rad3 related, ATR)的激活[25]。双链DNA断裂是DDR的强效活化剂, 能促进ATM激酶在DNA损伤位点聚集, 使组蛋白H2AX磷酸化, 最终激活ATM。ATM能磷酸化多种亚基, 包括两种必需的激酶:检查点激酶1 (checkpoint kinase 1, CHK1)和检查点激酶2 (checkpoint kinase 2, CHK2), 并能磷酸化P53, 激活P53通路, 引起细胞生长周期停滞和SASP分泌[26]。NF-κB对SASP的转录至关重要, 在细胞衰老或DNA损伤刺激时, NF-κB易位至细胞核, 与几个启动子共同作用结合SASP基因, 对其进行转录调节, 是SASP的“主要调节器”[27], 如图 1所示。SASP存在高度异质性, 主要受到以下三种途径的调节:表观基因修饰、转录水平和转录后水平[28]。

表观遗传变化是新发现的分子标志物, 可预测健康状况。表观基因组的改变能影响表观遗传, 从而影响衰老进程。表观遗传修饰包括多种类型, 这里主要从非编码RNA调控、DNA甲基化、蛋白质共价修饰三个方面进行论述[29]。

非编码RNA (non-coding RNA, ncRNA)包括微RNA (microRNA, miRNA)、长链非编码RNA (long non- coding RNA, lncRNA)[30]和环状RNA (circular RNA, circRNA)。ncRNA通过与蛋白质和DNA相互作用, 在转录、转录后和翻译后水平调节SASP基因的表达, 以达到对SASP的高度精确控制[31]。长链ncRNA在整个染色体水平发挥顺式调节作用, 而短链RNA主要在基因组水平对基因表达进行调控。

miRNA是SASP的主要内容, 它们表达为发夹结构, 通过多个步骤转化为单链RNA, 并被整合到RNA诱导的沉默复合物中, 识别并结合靶mRNA上的互补基因。在衰老进程中, miRNA显著上调, 可显著改变细胞的表型特征。作为衰老相关的潜在指标, 对于极长寿的个体, miRNA表达变化较少, 证明操纵miRNA可以控制SASP, 用于治疗老年病。例如miR-146a/b通过作用于IRAK1 mRNA (IL-1α信号通路的关键因子), 抑制SASP因子IL-6和IL-8的分泌, 从而负反馈抑制SASP的过度分泌; miR-17能调控年轻间充质干细胞(mesenchymal stem cells, MSC)分泌生长分化因子6 (Growth differentiation factor 6, Gdf6)[32], 从而减少IL-6、IL-1β和CCL-5等SASP因子水平, 表明上调Gdf6能抑制慢性炎症, 进而延缓衰老[33]。

多聚腺苷二磷酸核糖聚合酶1 (poly (ADP-ribose) polymerase-1, PARP-1)通过调节DNA甲基转移酶(DNA methyltransferase, DNMT)和组蛋白修饰酶的活性和定位, 从而影响染色质结构。PARP-1能抑制DNMT启动子活性, 从而保证抑癌基因(P53和PTEN)的正常表达。例如褪黑色素通过调节PARP-1, 抑制衰老细胞中SASP基因IL-6、IL-8、MMP-3和趋化因子配体20 (chemokine ligand 20, CCL20)的表达[34]。

新合成的组蛋白需经过翻译后修饰才具备一定的活性, 即组蛋白的共价修饰, 主要包括组蛋白乙酰化和甲基化反应。组蛋白修饰可通过影响转录因子与启动子的亲和性进行基因调控。其中, 乙酰化反应与基因的活化相关, 可调控基因转录和细胞分裂周期, 而甲基化反应可激活或抑制转录。

组蛋白去乙酰化酶(Sirt1)是一种NAD+依赖性脱乙酰酶, 可在细胞核和细胞质之间不断穿梭[35]。Sirt1能调节多种应激调节因子, 包括NF-κB、p53、缺氧诱导因子-1α (hypoxia-inducible factor-1α, HIF-1α)和叉头盒转录因子(forkhead box O, FOXO); 同时也能维持基因组和染色质的稳定性, 参与DNA损伤的信号传递和修复[36]。衰老进程中, Sirt1显著下调, 使得启动子区域的组蛋白H3 (K9)和H4 (K16)乙酰化增加, 导致IL-6和IL-8大量分泌[37]。

组蛋白去甲基化酶(Jumonji domain-containing protein 3, JMJD3)是一种抑制性的表观遗传标记, 通过对组蛋白H3 (demethylates lysine 27 on histone H3, H3K27me3)去甲基化, 调控免疫激活和损伤修复反应(包括再生和细胞衰老)。JMJD3过表达能刺激SASP因子IL-6、IL-8、单核细胞趋化蛋白1 (monocyte chemoattractant protein 1, MCP-1)和蛋白酶MMP-10、MMP-13、TIMP-1、TIMP-2和TIMP-4的分泌[38]。

细胞衰老后, 抑制性标志H3K9me2在IL-6和IL-8的启动子处减少, 可能是由于ATM依赖性DDR信号通路的激活, 使组蛋白甲基转移酶G9a降解, 导致SASP因子分泌增加所致[39]。

细胞受到非常严重的刺激后, 能引起衰老反应, 激活DDR, 而DDR的持续激活是SASP因子(如IL-6和IL-8)表达的必要条件。然而, DDR是在损伤后立即发生的, 而SASP的产生通常需要数日的时间, 这一过程需要P38丝裂原激活的蛋白激酶(P38 mitogen-activated protein kinase, p38MAPK)通路的参与。在DNA损伤后, p38MAPK通路被慢性激活, 通过增加NF-κB的转录活性诱导SASP的分泌, 上调IL-2、IL-4、IL-6、IL-8和TNF-α等细胞因子的表达[40], 这一过程是独立于DDR的。此外, P53可通过抑制p38MAPK通路抑制SASP, 避免SASP对组织微环境的损伤[41]。

cGAs (cGMP-AMP synthase)是DNA传感器, 位于非分裂细胞的细胞质中, 能激活先天免疫反应, 并导致细胞衰老。cGAs的缺失加速小鼠胚胎成纤维细胞自发永生化, 并消除自然衰老和DNA损伤剂诱导产生的SASP[42]。DNA损伤导致少量的DNA进入细胞质, 而衰老细胞中DNA酶(DNase2和TREX1)表达下调[43], 使细胞质染色质片段积累并异常激活cGAs。活化的cGAs产生第二信使环二核苷酸(cGAMP), 与干扰素基因刺激蛋白(stimulator of interferon genes, STING)结合, 促进STING与TANK结合激酶1(TANK-binding kinase 1, TBK1)和IκB激酶的聚集, 从而分别激活干扰素调节因子3 (interferon regulatory factor 23, IRF3)和NF-κB, 导致I型干扰素和IL-6、IL-8、IL-1β、MMP12等SASP因子的产生[44]。

GATA4是新的衰老调节途径, 通过NF-κB调节SASP, 进而调节衰老[45]。在这个途径中, DDR是衰老进程的发起者, 激活两个关键激酶ATM和ATR, 抑制自噬衔接子P62 (选择性自噬GATA4), 导致GATA4积累, 随后通过肿瘤坏死因子受体相关因子相互作用蛋白2 (tumor necrosis factor receptor-associated factor interacting protein 2, TRAF3IP2)和IL-1A激活NF-κB, 促进IL-6、IL-8、CXCL-1、GM-CSF等多种SASP因子的分泌, 诱导细胞衰老[46]。

JAK/STAT (Janus kinase/signal transducer and activator of transcription)途径在衰老细胞中高度激活, 是调节细胞因子产生的主要途径之一[47]。JAK/STAT途径通过配体(例如生长因子、干扰素或白细胞介素)与特异性跨膜受体的结合来激活JAK, 从而将信号转移至级联的细胞质部位。在细胞质中, 活化的JAK募集失活的STAT蛋白, 随后磷酸化STAT蛋白结构中的酪氨酸残基, 通过其SH2结构域与其他STATs形成稳定的二聚体STAT蛋白。STATs既是信号转导因子也是转录因子, 二聚化的STAT易位到核中, 能够在几分钟内激活非活性基因的转录[48]。例如: JAK2/STAT3途径, 能上调SASP因子, 主要是免疫抑制因子的表达, 如CXCL-1/CXCL-2、GM-CSF、IL-10和IL-13;在TNF-α诱导的衰老中, 能激活依赖STAT1/3的自分泌环, 通过正反馈机制上调细胞因子IL-8、IL-6、IL-1α、IL-1β、IL-32和趋化因子CXCL-1、CXCL-2、CXCL-5、CXCL-6、CXCL-10、CXCL-11、CCL2、CCL5、CCL20的表达[49]; 在老龄小鼠中, 给予JAK1/2抑制剂能显著抑制IL-6、IL-8、CXCL-1、MCP-1、MMP3等多种SASP的mRNA水平, 减轻脂肪组织和全身的炎症[50]。

mTOR通过促进SASP上游调节器IL-1A的转录, 以旁分泌和自分泌的方式触发炎症转录因子NF-κB和C/EBP-β的转录, 分泌IL-6和IL-8等SASP因子。此外, mTOR能激活p38MAPK的下游MAPK激活的蛋白激酶2 (MAPK-activated protein kinase 2, MAPKAPK2)的转录, 抑制RNA结合蛋白ZFP36L, 阻止其降解编码SASP因子的mRNA, 从而稳定许多SASP因子的mRNA水平[51]。

在衰老的癌症细胞和正常的成纤维细胞中, miR‐335显著上调。PTEN是miR‐335的靶标, 也是PI3-K/Akt信号通路的负调节因子。miR-335通过对PTEN的转录后调节, 下调其表达, 从而增加IL-6、MCP-1和MMP-2等促炎SASP的分泌。同时, 也观察到环氧化酶-2 (cyclooxygenase 2, COX-2)和前列腺素E2 (prostaglandin E2, PGE2)分泌增加, 且COX-2抑制剂塞来昔布能减少miR-335的表达, 恢复PTEN的表达。因此, miR‐335/ COX‐2/PTEN是调节SASP的一种新途径[52]。

雷帕霉素是哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mammalian target rapamycin, mTOR)抑制剂, 通过抑制mTOR通路, 减少SASP的分泌, 从而调节体内炎症反应, 延缓细胞衰老[53], 治疗老年性相关疾病。雷帕霉素延缓衰老的机制一方面与通过增加衰老细胞中Nrf2基因, 激活细胞自噬途径, 调节细胞周期停滞有关[54]; 另一方面, 可通过抑制STAT3途径, 并选择性抑制IL-1A的翻译, 减少IL-1、IL-6、IL-8、MMP-3、MMP-13、TNF-α等SASP基因的表达。

白藜芦醇是天然的植物抗毒素, 具有良好的保健价值和抗衰老功能。白藜芦醇通过Sirt1/NF-κB通路调节MRC5成纤维细胞衰老相关特征, 并减少大量SASP相关细胞因子的分泌[55]。NF-κB家族的转录因子, 包括Rel (RelA/p65)和NF-κB (p50), 它们在细胞质中彼此二聚化, 与IκB蛋白结合后以失活的状态保留在细胞质中[56], 其中RelA/p65的乙酰化是NF-κB激活的标志。白藜芦醇通过上调Sirt1降低RelA/p65和p-IκBα的mRNA水平, 从而抑制NF-κB的活性并减少多种SASP的表达, 如IL-1α、IL-1β、IL-6、IL-8和TGF-β; 基质金属蛋白酶MMP3和MMP2;胰岛素生长因子IGF-1R、TGFβ-R2和趋化因子受体4 (chemokine receptor 4, CXCR4)[57]。

人参皂苷F1能抑制星形胶质细胞的SASP, 治疗衰老相关脑部疾病。星形胶质细胞是中枢神经系统稳态、防御和再生的基础, 而阿尔茨海默症患者脑组织中存在衰老的星形胶质细胞, 且SASP因子的高度表达, 导致大脑功能下降。人参皂苷F1通过减少星形胶质细胞中p38MAPK的激活, 降低NF-κB活性, 从而减少IL-6、IL-8、MCP-1等SASP因子的分泌[58]。

阿达木单抗(adalimumab)是一种针对TNF-α的单克隆抗体, 能改善免疫系统的炎症反应, 调节细胞衰老, 并使SASP的促肿瘤发生和促转移行为减少; 此外, 还能抑制神经炎症, 改善阿尔兹海默症患者的认知功能障碍[59]。阿达木单抗通过诱导衰老细胞的表观遗传修饰miR-146a-5p和miR-126-3p, 降低IL-6、IL-1β等SASP因子的表达; 同时能降低NF-κB活性, 减少TNF-α和IL-6等细胞因子的产生[60]。

衰老细胞常出现线粒体功能障碍, 使衰老细胞的促存活途径(senescent cell anti-apoptotic pathways, SCAP)上调, 其自身分泌的促凋亡SASP对自己无效, 从而长期保持在衰老状态。Senolytic是杀死衰老细胞药物的总称, 通过干扰衰老细胞的SCAP途径激活细胞凋亡[61], 从而选择性地消除衰老细胞, 延缓衰老。达沙替尼是一种senolytic药物, 其与槲皮素的鸡尾酒混合物, 经小鼠口服后能选择性清除自然衰老小鼠中的衰老细胞, 而不损害健康细胞[62], 从根源上抑制了SASP的分泌, 从而改善了自然衰老小鼠的生理功能, 有效延缓衰老。

随着年龄的增长, 机体衰老细胞的自凋亡行为逐渐减少, 造成衰老细胞大量积累, 同时衰老细胞能持续分泌SASP, 破坏组织稳态, 显著促进衰老。细胞衰老是老年人组织老化的基础, SASP在衰老细胞的生理活动中具有重要作用[63], 一方面其促炎作用能保护机体免受细菌病毒的侵害, 并能促进伤口愈合、促进免疫系统及时清除衰老细胞等有益作用; 另一方面也能通过自分泌和旁分泌途径向周围细胞传递衰老信号, 加速机体衰老, 导致衰老相关疾病的发生。因此, 对SASP进行适当的调节, 对于延长寿命、治疗衰老相关疾病、提高老年人的晚年生活质量具有重要意义。

虽然目前已有很多SASP相关的研究, 且对SASP调节途径的研究不断丰富, 但每条通路、每个分子的微小变化都息息相关, 休戚与共。因此, 了解SASP通路、分子之间的内在联系, 以及SASP影响衰老及衰老相关疾病的具体机制, 仍需要研究者进行大量的探索。