液相芯片技术的原理与应用进展

液相芯片，也称为微球体悬浮芯片（suspension array，liquid chip），是基于xMAP（flexible Multi Analyte Profiling）技术的新型生物芯片技术平台，它是在不同荧光编码的微球上进行抗原 抗体、酶 底物、配体 受体的结合反应及核酸杂交反应，通过红、绿两束激光分别检测微球编码和报告荧光来达到定性和定量的目的，一个反应孔内可以完成多达100种不同的生物学反应，是继基因芯片、蛋白芯片之后的新一代高通量分子检测技术平台。

迄今为止十年时间，全球已有数百套基于xMAP技术的检测平台用于免疫学、蛋白质、核酸检测、基因研究等领域，该技术已成为一种新的蛋白质组学和基因组学研究工具，也是最早通过美国食品与药物管理局（FDA）认证的可用于临床诊断的生物芯片技术。

　　1 液相芯片技术的原理

　　液相芯片体系由许多大小均一的圆形微球（直径5.5～5.6 μm）为主要基质构成，每种微球上固定有不同的探针分子，将这些微球悬浮于一个液相体系中，就构成了一个液相芯片系统，利用这个系统可以对同一个样品中的多种不同分子同时进行检测，这种被称之为xMAP的检测技术是1997年由美国Luminex公司开发出来的。

　　在液相系统中，为了区分不同的探针，每一种固定有探针的微球都有一个独特的色彩编号，或称荧光编码。在微球制造过程中掺入了红色和橙色两种荧光染料（这两种染料各有10种不同区分），从而把微球分为100种不同的颜色，形成一个具有独特光谱地址的含有100种不同微球的阵列。不同颜色微球在分类激光激发下产生的荧光互不相同，这种分类荧光是识别不同微球的唯一途径。利用这100种微球，可以分别标记上100种不同的探针分子。

检测时先后加入样品和报告分子与标记微球反应，样品中的目的分子（待检测的抗原或抗体、生物素标记的靶核酸片段、酶等）能够与探针和报告分子特异性结合，使交联探针的微球携带上报告分子藻红蛋白，随后利用仪器（如Luminex 100）对微球进行检测和结果分析。Luminex 100采用微流技术使微球快速单列通过检测通道，并使用红色和绿色两种激光分别对单个微球上的分类荧光和报告分子上的报告荧光进行检测。红色激光可将微球分类，从而鉴定各个不同的反应类型（即定性）；绿色激光可确定微球上结合的报告荧光分子的数量，从而确定微球上结合的目的分子的数量（即定量）。因此，通过红绿双色激光的同时检测，完成对反应的实时、定性和定量分析。

2 液相芯片技术的优点

　　液相芯片技术最突出的优点在于：仅需少量样本即可同时定性、定量检测同一样本中的多种不同目的分子，即多重检测（multiplexing）。具体说来，与常规免疫学或核酸检测方法相比，液相芯片技术具有以下显著优点。

2.1 高通量

可对同一样本中的多种不同目的分子同时进行实时、定性、定量分析。从理论上说，如果不存在交叉反应，检测的通量等于微球的种类数，目前最多可达到100种。这远胜过一次只能检测一个项目的传统免疫分析法。

2.2 样本用量少

由于在同一个反应孔中可以同时完成100种不同的生物学反应，所以大大节省了样本用量，少至1μl的样本即可检测，非常适合分析小体积稀有样品。

2.3 操作简单、快速

由于是基于液相反应动力学，因此反应速度快，孵育时间比传统的固相检测短。进行免疫学分析时，若使用高亲和力抗体，2～3 h内即完成检测，而核酸杂交分析在PCR扩增后1 h内可得到结果。

2.4 灵敏度高

微球表面积大，每个微球上可包被100 000个捕获抗体，如此高密度的捕获抗体保证了能够最大程度地与样本中的抗原分子结合，提高检测灵敏度。最低检测浓度可达到0.1 pg/ml.

2.5 检测范围广

可达3～5个数量级（如Bio Rad公司细胞因子检测试剂盒的检测范围达到0.2～32 000 pg/ml，样品无需浓缩或稀释。

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2.6 特异性强

无需洗涤就能够自行将和微球结合的与未结合的分子区分开来，只读取单个微球上的荧光信号，信噪比好。

2.7 准确性高

微球上的报告分子荧光强度与结合的待测分子成正比。由于液相芯片技术的检测范围大，因此不需要象ELISA检测中那样需将样本多倍稀释，从而减小了误差。

2.8 重复性好

这是由于：第一，与ELISA依靠酶放大作用的比色读数相比，液相芯片技术中的荧光读值更加直接、稳定、灵敏；第二，每种微球检测100个，最终取荧光强度的中值作为结果，这相当于对每个样本重复检测了100次，而ELISA仅为双复孔或三复孔，因此液相芯片检测结果的准确性和重复性是ELISA无法比拟的。

2.9 费用低

同时检测一个样本中的多项指标可节约时间、样本、试剂、耗材和劳动（比ELISA法低10～100倍），降低检测成本，同时还提高了分析效率，仅需少量样本即可获得大量信息。目前同时检测10项细胞因子的液相芯片试剂的费用大约为＄1300/96孔（＄130/项/96孔），这比检测单项指标的ELISA试剂的成本（＄500/项/96孔）低得多，而且还可随检测指标的增加而进一步降低费用。

2.10 灵活

适用于各种蛋白质和核酸的分析。商品化试剂盒的使用者只需增减探针交联微球和标记分子即可满足不同检测项目的需要。

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　　3 液相芯片技术的应用进展

　　液相芯片是继平面芯片之后的一种新型芯片技术，是一种非常灵活的多元分析平台，在核酸、蛋白质等生物大分子的大规模分析中具有巨大的应用潜力，可用于免疫分析、核酸研究、酶学分析、受体配体识别分析等众多领域的研究，蛋白质蛋白质相互作用、蛋白质核酸相互作用分析等都可以在同一个平台上实现。

鉴于液相芯片技术在高通量定性和定量检测上令人瞩目的优势，目前它在基因组学研究、蛋白质组学研究、药物开发、基础研究和临床诊断等方面的应用十分广泛，近几年来以此为平台的产品开发和应用十分活跃，研究者既可以根据研究需要自行制备探针交联微球，建立反应体系，也可使用种类繁多的商品化试剂盒进行分析。大体说来，液相芯片技术的应用包括两大部分：液相蛋白芯片和液相基因芯片，前者主要是基于抗原抗体反应，而后者实质为核酸杂交。现将液相芯片技术在检测细胞因子、病原微生物、基因突变以及HLA、基因表达分析、细胞信号转导途径研究等方面的应用综述如下：

3.1 定量检测细胞因子

　　细胞因子参与多种免疫机能，某些细胞因子具有相同功能，并且调节其它细胞因子的合成和分泌，因此同时检测多种细胞因子有利于全面判断机体免疫功能、了解分子水平的免疫调节机制，在疾病的诊断、病程观察、疗效判断及细胞因子治疗监测方面有重要意义，还可用于研究发病机制、药物作用机理和药物临床试验。

　　目前最常用于检测体液和细胞培养上清中细胞因子的方法有ELISA、TRFIA等，这些方法灵敏度、特异性和准确性都较好，但是也存在一些局限：每次仅能检测一种细胞因子，如果需要同时分析多种细胞因子，则检测费用较为昂贵并且费时，完成检测所需的样本量较大，非常浪费，对于一些量少的样本（如鼠血清、儿童患者标本）就比较困难。能够同时检测数种细胞因子的方法有RTPCR、Northern Blot等，但它们均不能准确定量分泌性细胞因子，而且每次检测的细胞因子数目有限。

　　用传统方法检测多种细胞因子时，要求的样品量多，费用高，ELISA的检测范围仅1～2个数量级，而液相芯片可同时检测同一样品中的多种分子，而且具有特异、快速、灵活、重复性好的特点，其检测范围为3～4个数量级，检测灵敏度也远胜于ELISA，其优势是显而易见的。因此定量检测细胞因子成为目前液相芯片技术应用最为活跃和广泛的领域之一，尤其是2004年以来，随着市场上越来越多的商品化试剂盒的涌现，液相芯片技术检测细胞因子的文献报道数量迅猛增加，大有取代常规ELISA方法之势。

de Jager［1］自行制备抗体交联微球，同时检测了人血浆和关节滑液中的30种细胞因子、趋化因子和粘附分子，其检测灵敏度为1.0～26.4 pg/ml，检测范围达4个对数值；检测添加上述分子正常人血浆的回收率为83%～119％，平均批内变异系数为8.1％，平均批间变异系数为11.4％；液相芯片与ELISA法检测结果的相关系数R2为0.88～0.99。

　　国外多家公司已推出了商品化的细胞因子液相芯片检测试剂盒，比如R&D 公司的Flurokine MAP系列、Linco Research公司的LINCOplex 试剂盒、BioSource公司的Antibody Bead Kit、Bio Rad公司的Bio Plex系列等，可用于来自人、小鼠、大鼠的样品，既有一次检测单种细胞因子的试剂盒，也有预先混合多种细胞因子抗体交联微球而一次检测多个指标者，研究者还可根据自身需要自行选购某几种交联微球。

这些试剂盒在检测灵敏性、准确性、可靠性等方面都具有很好的性能，如Bio Rad公司的Bio Plex细胞因子检测试剂盒，其灵敏度可达2～4 pg/ml，最高检测浓度可达16 000～32 000 pg/ml，线性检测范围为3～5个数量级，批内和批间变异系数小于10％。不过这些试剂盒均未获得FDA用于体外诊断的批准，仅限于实验研究用途。如Funding［2］ 用Bio Rad公司的Bio Plex试剂盒同时定量测定角膜移植排斥患者房水中的17种细胞因子，发现这些患者的细胞因子水平显著增高。Szodoray［3］用Biosource公司的试剂盒检测了9名原发性Sjogren综合征患者血浆中可能与细胞死亡有关的25种细胞因子水平，发现某些细胞因子水平在患者与健康人之间差异显著，作者认为能同时检测多种细胞因子的液相芯片技术可成功用于诊断Sjogren综合征及个性化抗细胞因子治疗。

　　与传统ELISA方法相比，液相芯片除了能同时检测细胞培养上清、血清、血浆、全血、组织匀浆液、泪液、脑脊液甚至新生儿干血斑等标本中的多种细胞因子，一次检测即可确定Th1/Th2特异性免疫应答，能为了解免疫应答中的细胞因子分泌情况提供更为全面的信息外。

还至少具有以下优点：①比ELISA灵敏度更高，标准曲线在更低的浓度仍能保持线性：这是因为液相芯片与ELISA依靠酶放大作用的间接检测相比，荧光读值更直接、稳定、灵敏；此外，液相芯片检测中洗涤更彻底，微球表面积小，减少了非特异性结合；而且交联抗体是共价结合于微球上，这不同于ELISA依靠疏水作用通过物理吸附与固相载体结合。②比ELISA更准确：液相芯片最后报告的荧光值为100个微球荧光检测结果的中值，相当于重复进行了100次检测。③更经济：一次可对10～20余种细胞因子进行定量分析，检测单种细胞因子的试剂用量显著降低，样本需要量少（最多仅需100 μl），而ELISA检测同样数目的细胞因子需要数毫升样本。据估算，同时检测8种人细胞因子的费用仅为ELISA的1/17，样品用量仅为后者的1/20，因此大大节省了人力、时间和费用。

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3.2 检测SNP

　　单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism，SNP) 是指在基因组水平上由于单个核苷酸改变所引起的DNA序列多态性。它是人类可遗传的变异中最常见的一种，占所有已知遗传多态性的90%以上。SNP在人类基因组中广泛存在，平均每500～1 000个碱基对中就有1个，估计其总数可达300万个甚至更多。随着人类基因组计划的完成，基因组多态性研究，尤其是SNP检测，已经成为一个重要的研究热点。

　　利用液相芯片技术进行SNP分析的研究报道已有很多，在此平台上可应用多种不同的SNP基因型分析方法，如单碱基链延伸法（single base chain extension，SBCE）、等位基因特异性引物延伸法(allele specific primer extension，ASPE)、寡核苷酸连接法、直接杂交法、竞争杂交法等。

　　采用液相芯片技术进行SNP分析，96孔板上每孔可检测50种SNP，仪器分析96个孔的数据只需1小时，这样每台仪器每天（8h）可完成30 000个以上基因型的检测，每个SNP的平均检测费用据估算不到＄0.20（不包含PCR费用），并且主要取决于SNP数目、联检项目数量、标本数量、人力和试剂费用等因素。因此，用液相芯片进行SNP分析比DNA测序或者基因芯片操作简便、快速、高效、准确、重复性好、通量高、费用低，而且单管反应即可检测多种SNP，在研究SNP与疾病（心血管疾病、肥胖、肿瘤等）发生、法医鉴定等方面具有显著的优势和广阔的应用前景。

Nishihama［4］ 为评价有或无冠心病常见危险因素（高血压、高血脂、糖尿病）者基因多态性与心肌梗塞之间的关联，采用液相芯片法（PCR与序列特异性寡核苷酸探针杂交）确定了3 483人（1 192名心肌梗塞患者、2 291名对照）137个候选基因的164种多态性的基因型，发现9种不同的多态性与心肌梗塞显著相关（P