FISH

实验步骤

1. DNA探针的制备质粒DNA克隆的提取、纯化和鉴定。    1) 用接种环挑取一小块-70℃冻存的转化菌，接种于5mL LB培养基中，37℃剧烈震荡过夜。    2) 将收集到的菌液3000r/min离心10min，弃掉上清液。    3) 向菌体沉淀中加入溶液I300mL，溶液II 350mL，混匀后将其置于冰浴中片刻，再加溶液III 350mL混匀，加酚和氯仿混合液(体积比为1：1)500mL 后充分混匀。    4) 12000r/min离心10min。    5) 取上清液，向其加入600mL异丙醇，充分混匀后以12000r/min离心15～30min，弃掉上清液。    6) 用1500mL体积分数70%乙醇洗涤沉淀2～3次，晾干。    7) 用TE缓冲液溶解DNA沉淀。    8) 加水至200mL，以Rnase A(终浓度200mg /mL)在50℃水浴中消化30min。    9) 加入酚、氯仿和异丙醇(三者体积比25：24：1)溶液200mL混匀，12000r/min离心2min。    10) 取上清液，再加入氯仿和异戊醇溶液(体积比为24：1)200mL混匀，12000r/min离心2min。    11) 取上清液，以20mL 3M NaAc及500mL体积分数100%乙醇沉淀DNA。    12) 可将上述溶液在-70℃放置30min至1h以充分沉淀DNA，然后用12000r/min离心15min。    13) 将沉淀用1.5mL体积分数70%乙醇轻洗，自然晾干。    14) 用TE缓冲液溶解DNA。    15) 取1～2mL上述纯化的DNA溶液，于8.0g/L琼脂糖/TBE缓冲液凝胶电泳鉴定DNA并检测浓度。    16) 取1mg DNA，用相应限制性内切酶4～5单位，BSA100～200mg /mL，于37℃水浴中酶解2～4h。    17) 电泳观察，根据酶切片段数量及大小，估计DNA克隆插入片段大小。2. 探针的生物素标记探针的标记可采用PCR或缺口平移法来制备，但多数情况下采用缺口平移法来制备。该过程包括以DNase I在DNA双链上作用产生缺口并以此作为第二反应步骤的作用赳噗，即大肠杆菌聚合酶I自缺口处进行修补合成。在修补合成互补链时将生物素标记的d-NTP掺入，从而复制出带有生物素标记的探针。本实验采用缺口平移法，按GIBCO公司提供的方法以biotin-14-dATP标记探针。标记好的探针可以在-20℃下长期保存。总反映体积50mL， DNA 1mg，10×dNTP 5mL，10×Enzyme Mix 5mL。其中10×dNTP为：500mmol/L Tris·HCl(pH 7.8) 50mmol/L MgCl2 100mmol/Lβ-硫基乙醇 100mg /ml去除核酸酶的牛血清白蛋白 0.2mmol/L dCTP，0.2mmol/L dGTP，0.2mmol/L dTTP 0.1mmol/L dATP，0.1mmol/L biotin-14-dATP 10×酶混合为： 0.5units/mL DNA聚合酶I 0.075untis/mL Dnase I 50mmol/L Tris·HCl(pH 7.5) 5mmol/L醋酸镁 1mmol/L β-硫基乙醇 0.1mmol/L苯甲基磺酰氟

体积分数50%甘油 100mg /mL牛血清白蛋白 将上述混合液于16℃作用1h。用8.0g/L琼脂糖/TBE缓冲液凝胶电检测标记产物。以DNA片段长约300～500bp为宜。如片段较大，则应加适量Dnase I继续酶切，直至DNA片段长度适中后，加5mL终止缓冲液(300mmol/L EDTA)终止反应。用乙醇沉淀的方法将探针与非掺入的核苷酸分开。 3. FISH实验方法及步骤    1) 探针及标本的变性探针变性： 将探针在75℃怛温水浴中温育5min，立即置0℃，5～10min，使双链DNA探针变性。标本变性：       a. 将制备好的染色体玻片标本于50℃培养箱中烤片2～3h。(经Giemsa染色的标本需预先在固定液中退色后再烤片)。       b. 取出玻片标本，将其浸在70～75℃的体积分数70%甲酰胺/2×SSC的变性液中变性2～3min。       c. 立即按顺序将标本经体积分数70%、体积分数90%和体积分数100%冰乙醇系列脱水，每次5min，然后空气干燥。    2) 杂交 将已变性或预退火的DNA探针10mL滴于已变性并脱水的玻片标本上，盖上18×18盖玻片，用Parafilm封片，置于源潮湿暗盒中37℃要交过夜(约15～17h)。由于杂交液较少，而且杂交温度较高，持续时间又长，因此为了保持标本的湿润状态，此过程在湿盒中进行。    3) 洗脱 此步骤有助于除去非特异性结合的探针，从而降低本底。       a. 杂交次日，将标本从37℃温箱中取出，用刀片轻轻将盖玻片揭掉。       b. 将已杂交的玻片标本放置于已预热42～50℃的体积分数50%甲酰胺/2×SSC中洗涤3次，每次5min。       c.在已预热42～50℃的1×SSC中洗涤3次，每次5min。       d.在室温下，将玻片标本2×SSC中轻洗一下。    4) 杂交信号的放大       a. 在玻片的杂交部位加150mL封闭液I，用保鲜膜覆盖，37℃温育20min。       b. 去掉保鲜膜，再加150mL avidin-FITC于标本上，用保鲜膜覆盖，37℃继续温育40min。       c. 取出标本，将其放入已预热42～50℃的洗脱液中洗涤3次，每次5min。       d. 在玻片标本的杂交部位加150mL封闭液II，覆盖保鲜膜，37℃温育20min。       e. 去掉保鲜膜，加150mL antiavidin于标本上，覆盖新的保鲜膜，37℃温育40min。       f. 取出标本，将其放入已预热42～50℃的新洗脱液中，洗涤3次，每次5min。       g. 重复步骤1)、2)、3)，再于2×SSC中室温清洗一下。       h. 取出玻片，自然干燥。       i. 取200mL PI/antifade染液滴加在玻片标本上，盖上盖玻片。    5) 封片 可采用不同类型的封片液。如果封片中不含有Mowiol(可使封片液产生自封闭作用)，为防止盖片与载片之间的溶液挥发，可使用指甲油将盖片周围封闭。封好的玻片标本可以在-20～-70℃的冰箱中的暗盒中保持数月之久。    6) 荧光显微镜观察FISH结果 先在可见光源下找到具有细胞分裂相的视野，然后打开荧光激发光源，FITC的激发波长为490nm。细胞被PI染成红色，而经FITC标记的探针的探针所在位置发出绿色荧光。由于本实验使用的是Y染色体上的特异序列，因此在男性外周血染色体标本的杂交中呈阳性，即使在末分裂的细胞中，也可以观察到明显的杂交信号。照相记录实验结果。