Nature Protocols

EVs磷酸化蛋白质组学和糖蛋白质组学分析实验流程。EVs的分离、磷酸肽和糖肽的富集以及nanoflow LC-MS分析的工作流程。通过连续高速和超高速离心从人血浆中分离微泡和外泌体。裂解EVs，并在SDC缓冲液中提取和消化蛋白质。依次富集磷酸肽和N-糖肽，然后进行LC-MS/MS分析。N：天冬酰胺；P：磷酸化；S：丝氨酸；T：苏氨酸。

实验步骤：

1. 血浆准备● 耗时40分钟

Ÿ 室温下，在K2EDTA采血管中以1300 g离心~2 mL新鲜血液（可得~1 mL血浆）离心10分钟，以去除血细胞、碎片和大的凋亡小体。收集上清液。

注意：从新鲜血液中获取1 mL血浆，起始的最佳体积为2 mL。根据作者的经验，这是处理后将产生可见沉淀物和用于PTM分析和定量的最佳产量的最少量血浆（1 mL）。根据我们的经验，在消化之前，从1 mL血浆中可以得到20–100 µg蛋白质。视血浆、疾病和其他因素而定。对于一式三份，我们建议将初始血浆量（3 mL）增加三倍，以有足够的样品进行定量。

Ÿ 在室温下4,000 g离心上清液15分钟以去除血小板。收集上清液~1毫升。

注意：在血沉棕黄层上方留出30–50 µL血浆，避免产生污染。血浆样品可以在−80°C下保存长达1-2年。在使用前，在37°C水浴中融化血浆样品。

2. EVs纯化● 耗时3–4小时

Ÿ 在4°C下20,000 g离心血浆样品1 h。（此步骤的沉淀用PBS重悬，再次20,000 g离心1 h可得MVs。）

Ÿ 收集上清液用于外泌体纯化，使用超速离心机在4°C下以100,000g离心。

Ÿ 除去上清液，并使用1 mL过滤的PBS洗涤沉淀。在4°C下再次以100,000g离心1小时。

Ÿ 除去上清液。沉淀包含外泌体。

注意：外泌体不如MV可见。确保在靠近沉淀物的地方小心吸（大部分时间大部分情况下是不可见的）。

3. EVs鉴定● 耗时不定

一般采用WB检测外泌体标志性蛋白（例如CD9、CD63、CD81、α-actinin-4、CD40和mitofilin）；NTA检测的大小分布和浓度；大小和形状可以使用电子显微镜或原子力显微镜（AFM）检测。

4. EVs裂解、还原和烷基化● 耗时10–20分钟

Ÿ 用100 µL EV裂解、还原和烷基化缓冲液重悬外泌体和MV，使其溶解。

Ÿ 溶解后，将样品在95°C加热5分钟。

Ÿ 加入400 µL胰蛋白酶缓冲液，将烷基化蛋白质稀释五倍。

Ÿ BCA检测蛋白质浓度。

5. 酶消化●耗时16–18小时

Ÿ 在37°C下，以1：100（wt/wt）的酶/蛋白质比例用Lys-C消化20–100 µg样品3小时。总体积应为500 μL。

Ÿ 以1:50（wt/wt）酶/蛋白质比例添加胰蛋白酶，并在37°C下孵育过夜。

Ÿ 以终浓度0.5％（vol/vol）添加TFA，酸化消化的肽，并向500 μL的消化溶液中添加500 μL乙酸乙酯。

Ÿ 将溶液Vortex 2分钟，然后在室温20,000 g离心2分钟，以获得水相和有机相。丢弃最上面的有机层。

Ÿ 重复步骤上面的乙酸乙酯离心2步，以除去尽可能多的洗涤剂残留物（添加乙酸乙酯，Vortex并丢弃顶部有机层；不要再次添加TFA）。收集水相并在真空离心机中干燥。

6. C18脱盐●耗时1小时

7. 磷酸肽富集●耗时1–2小时

8. 糖肽富集●耗时~8小时

9. 糖肽的StageTip脱盐●耗时1小时

10. LC–MS/MS●耗时~1小时/检测

11. 结果分析●耗时>1天

详细protocol可下载该文献查阅。

连续/分别的磷酸肽和糖肽富集实验示意图

维恩图显示重复之间的磷酸肽和磷酸蛋白重叠以及单独的（separate）和先后连续的（sequential）工作流程之间的重叠

维恩图显示重复之间的糖肽和糖蛋白重叠以及单独的（separate）和先后连续的（sequential）工作流程之间的重叠

参考文献：

HillaryAndaluz Aguilar, Anton B. Iliuk, I-Hsuan Chen & W. Andy Tao. Sequential phosphoproteomics and N-glycoproteomics of plasma-derived extracellular vesicles. Nature Protocols 2019 Dec 20. doi:10.1038/s41596-019-0260-5.

本文转自外泌体之家

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