酶联免疫吸附（ELISA）实验

一、ELISA影响因素

1.  试验样品血清、血浆或其他体液，均可作为ELISA的试验样品（标本）。但应注意分离血清时，血液要求放置室温中凝固收缩，不宜置冰箱（4℃）中凝固，否则会使大部分IgM和少量IgG丧失活性。关于人血清在保存过程中抗体的稳定性报导尚不多。但一般认为作ELISA血清最好要新鲜，若要贮藏，必须少量分装保存于低温冰箱，并防止反复冻融。血浆可用肝素毛细管法采血，而血清可用滤纸片法采血。

被检血清或血浆标本，可用含保护性封阻剂（吐温-20）或称湿润剂的缓冲液来稀释。也可加入一些蛋白质，如1%牛血清白蛋白等来稀释。然后再加到已经用抗原或抗体包被的固相载体中进行孵育。此种被试标本可作一系列稀释度测定，也可用一个稀释度测定。对于作某一个传染病的诊断来说，最好先用一系列稀释度作一批标本测定，求出对诊断有意义的一个稀释度（即测定剂量反应曲线），然后用一个稀释测定即可。最适稀释度和孵育时间均需从实践中摸索出来，对一般病原微生物所引起的传染病的血清学诊断，以1：200稀释度测定比较适当，而试验标本的(即含抗体)作用时间一般为室温或37℃ 1-2小时。但现在对有些标本（如流脑抗原）测定时，仅用37℃ 5分钟。对单克隆抗体检测也可缩短作用时间。

2.  洗涤剂与稀释剂为了使特异性结合的抗体量尽可能多，包被微量反应板凹孔的抗原应该稍微过量。但在孵育或洗涤过程中，已吸附的抗原可能有部份会从固相载体上被洗涤下来。从而使加入被检血清中的特异性抗体以外的蛋白质很可能会吸附到原来包被抗原凹孔的空白处，增加本底颜色，产生假阳性反应,这是限制ELISA特异性的一个因素。因此不少学者在稀释剂及洗涤剂中加入各种保护性阻剂来抑制非特异性蛋白的竞争性吸附作用。已经证明牛血清白蛋白（BSA）和吐温-20有良好的封阻作用。其加入的量BSA为0.5%～1%；吐温-20为0.05%。（有人曾经比较了四种洗涤剂，结果认为蒸馏水加0.05%吐温-20或0.02 mol/L PBS（PH7.4）加0.05%吐温-20都是良好的）。在一般的洗涤剂和稀释剂中还加有NaN3防腐，但是用HRP制备酶结合物时则不能加NaN3，因NaN3能抑制HRP的活性，需要注意BSA加入洗涤剂或稀释剂中虽可改善ELISA的结果观察，但由于BSA比较昂贵，又不易得到，故也不是非加不可的。有人在洗涤剂中加入0.1%白明胶，2%免血清，有利于加强封阻作用。最近有人报告用PH7.4 0.02 mol/L Tris-Hcl缓冲液中加入0.05%吐温-20作洗涤剂，效果很好，被检血清和酶结合物的稀释剂，可与洗涤剂相同，但不需加0.2‰的KCl。

在稀释剂和洗涤剂中所加的吐温-20很重要。它不仅能消除非特异性的本底反应，而且还可增加阳性标本的敏感度，这可能与吐温-20能分离所吸附的非特异性物质有关。目前采用的洗涤剂为PH7.4 PBS（含0.2‰KCL）加0.05%吐温-20，如无吐温-20，也可用吐温故-40或吐温-60代替。但吐温-80本底较高，不宜应用。（0.5 mol/L NaCL）和2%兔血清加入稀释剂中，可提高特异性。