王辉教授：肺炎克雷伯菌流行致病研究前言

近年来，随着碳青酶烯类抗生素的广泛使用，耐碳青酶烯类肺炎克雷伯杆菌（CRKP）检出逐年递增，区域爆发流行的报道也屡见不鲜，CRKP感染引起的病死率非常高，已对全球人类健康构成严重威胁。

今天，检验君带来的是北京大学人民医院检验科王辉教授关于肺炎克雷伯菌流行致病研究前沿。

一种新型质粒介导的

替加环素耐药外排泵基因

CRKP在耐碳青霉烯肠杆菌中占比高达70%，替加环素和黏菌素被认为是目前临床治疗的最后一道防线，但过多的替加环素和粘菌素的使用也增加了耐药菌株的出现。目前已经发现质粒介导的对几种重要抗菌剂的抗性，而质粒介导的替加环素抗性在很大程度上还不清楚。

近日，北京大学人民医院检验科王辉教授课题组在CRKP中发现了一个位于质粒可水平转移的替加环素耐药外排泵基因tmexCD1-toprJ1，还在同一个质粒上发现了黏菌素耐药基因mcr-8。该研究发表在《Emerging Microbes & Infections》。

研究人员通过宏基因组测序以及近亲菌株之间的替加环素耐药表型差异的分析，发现了位于质粒上携带的RND家族外排泵tmexCD1-toprJ1。通过将该泵基因克隆进大肠埃希菌DH5α以及肺炎克雷伯菌ATCC13883中，发现该外排泵基因的存在会导致受体菌对替加环素的耐药水平上升8-16倍。

从10536株阴性肠杆菌中分离到257株替加环素不敏感的肺炎克雷伯菌株，其中包括236株患者分离株和21株动物来源菌株。发现tmexCD1-toprJ1在替加环素不敏感的患者分离株中流行率约为2.5%，而在替加环素不敏感的动物来源菌株中流行率高达52.4%。此外，在tmexCD1-toprJ1阳性菌株中还发现了一个新的mcr-8的变种mcr-8.5。

通过构建进化树分析表明，外排泵基因tmexCD1-toprJ1以及mcr-8.5很大可能来自动物分离株，并由动物传播至人类。

研究人员表示，该研究结果突显了tmexCD1-toprJ1，mcr8共存的IncFIA/ IncFII质粒对广大公众健康的重大威胁，它们对替加环素和粘菌素都具有移动耐药性，因此迫切需要对该质粒进行进一步的全球监测。

文章链接：

https://www.tandfonline.com/doi/full/10.1080/22221751.2020.1768805

产NDM-1和KPC-2酶的碳青霉烯耐药肺炎克雷伯菌转移和进化能力

CRKP自20世纪90年代出现以来，逐渐在世界范围内流行，已成为院内感染患者死亡的独立危险因素，且携带KPC-2和NDM-1的CRKP（KPC-2-NDM-1-CRKP）具有更高水平的耐药性。

日前，北京大学人民医院检验科王辉教授课题组的一项研究鉴定出7株KPC-2-NDM-1-CRKP，并基于临床信息、表型实验以及全基因组测序分析，揭示KPC-2-NDM-1-CRKP的发生和发展等特点。该研究发表在《EBioMedicine》。

该研究对2057株CRKP菌株进行碳青霉烯酶基因的PCR和Sanger测序，鉴定KPC-2-NDM-1-CRKPs。结果鉴定出7株KPC-2-NDM-1-CRKP，发生率虽然目前较低，但存在升高的趋势。其中有2株分离自同一医院，有3株分离自同一地区，分离时间相隔数月，提示KPC-2-NDM-1-CRKP具有传播能力，并在临床环境下能稳定存在。

药敏实验确认KPC-2-NDM-1-CRKP具有广泛的耐药性，特别是对新上市的头孢他啶/阿维巴坦MIC>128mg/L。质粒相容实验显示NDM-1质粒和KPC-2质粒可稳定共存；结合实验显示NDM-1质粒比KPC-2质粒更容易转移；稳定性实验显示大部分菌株的NDM-1质粒和KPC-2质粒可稳定携带；生长曲线显示额外携带NDM-1质粒或KPC-2质粒并没有降低菌株的适应能力。

通过二代和三代测序获得全基因组序列。基因组相似性同菌株分离时空距离一致，进一步确认了KPC-2-NDM-1-CRKP的克隆传播。KPC-2均位于IncFII质粒，而NDM-1质粒背景多样。质粒分析显示公共数据库中的同源KPC-2质粒多发现于肺炎克雷伯菌中，而同源NDM-1质粒的宿主背景多样。

总之，该研究揭示了KPC-2-NDM-1-CRKP发生路径，发现这些菌株具有较高的稳定性和适应性，警示未来暴发的风险，为KPC-2-NDM-1-CRKP的临床防控提供基础。

文章链接：

https://www.thelancet.com/journals/ebiom/article/PIIS2352-3964(19)30814-X/fulltext

碳青霉烯类耐药肺炎克雷伯菌的毒力演变

近年来，我国对碳青霉烯类耐药高毒力肺炎克雷伯菌（CR-hvKP）的报道越来越多，但目前尚缺乏关于CR-hvKP的纵向、多中心的分子流行病学研究，CR-hvKP的发展趋势仍不清楚。

日前，北京大学人民医院检验科王辉教授课题组的一项研究率先提供了CR-hvKP的多中心分子流行病学数据，并阐明了CRKP菌株毒力的纵向演变，以及我国毒力质粒的特征。该研究发表在《Journal of Antimicrobial Chemotherapy》。

该研究回顾性调查了2015年-2017年间我国56家中心的CRKP，并筛选了4个毒力基因（iucA、iroN、rmpA和rmpA2）以确定是否存在毒力质粒。用高粘液粘度、血清杀灭和梅隆内拉凯丹菌杀灭试验，对4种毒力基因菌株进行了CR-hvKP鉴定，并探究了CR-hvKP的荚膜分型、适合度和质粒特征。

结果发现，在收集到的1052个CRKP中有34.2%携带毒力基因，72例携带全部毒力基因。在大蜡螟感染模型模型，55例（76.4%）被认为是CR-hvKP，其中KPC-2产生型K64-ST11最常见（80%）。不同地区CR-hvKP流行率差异较大，以河南（25.4%）和山东（25.8%）最高。

在产KPC-2的ST11菌株中观察到CR-hvKP显著增加，从2015年的2.1%增加到2017年的7.0%。与普通的CRKP相比，CR-hvKP之间的生长没有差异，表明存在潜在的传播风险。从pLVPK和带有blaKPC-2的抗性质粒进化出了具有毒力和耐药性的杂交质粒，这表明在高毒力和高抗性质粒之间存在进化。

该研究表明，我国CR-hvKP的检出率呈上升趋势，由于CR-hvKP不表现明显的适应性，且可能发生耐药和毒力质粒的进化，因此，需加强临床的认识和感控措施。

文章链接：

https://academic.oup.com/jac/article-abstract/75/2/327/5622907?redirectedFrom=fulltext

多重耐药肺炎克雷伯菌医院暴发菌株

的快速表型进化

医院内抗菌素耐药性（AMR）的发生率在不断上升，已对世界各地医院的患者构成巨大威胁。在多药耐药性医院病原体中，CRKP是最令人担忧的病原体。导致全球医院内死亡率越来越高。

日前，北京大学人民医院检验科王辉教授课题组开展CRKP分离株监测计划，探究了blaKPC-2分离株的全基因组多样性，描述了耐药性的遗传背景，并通过整合基因组和流行病学数据重建了医院内的传播途径。该研究发表在《Microbial Genomics》。

该研究对发生了blaKPC-2阳性CRKP感染者死亡的医院进行了为期14个月的密切监测，以探究所有blaKPC-2阳性CRKP的特征。在14个月中，共分离出100株blaKPC-2阳性菌进行全基因组测序。构建进化树分析确定了一个密切相关的集群82序列11型（ST11）菌株，且在开始取样工作之前已经流通了至少一年。

这些分离株的大多数传播涉及重症监护病房的患者，表明重症监护室是传播的关键环境。虽然在监测过程中收集到的82株ST11菌株都有密切相关的染色体，但该研究观察到它们的AMR表型具有广泛的多样性，包括抗性基因、毒力相关基因和质粒携带的变异。

研究人员通过重建主要基因组从而支撑AMR谱中这种变化，包括整个质粒的多次得失和质粒之间的重组事件，包括blaKPC-2的转座。还确定了质粒拷贝数的变化与表型耐药水平相关的特定病例，表明菌株携带的耐药元件的数量可能在决定AMR水平中发挥作用。

该研究强调全基因组测序在调查多药耐药医院感染中的流行病学价值，并表明标准分型方案不能捕捉到CRKP分离株异常快速的基因组进化。

文章链接：

https://www.microbiologyresearch.org/content/journal/mgen/10.1099/mgen.0.000263

糖尿病患者NETs介导的CR-hvKP杀伤力受损机制

越来越多的证据表明，T2D患者感染hvKP的风险更高。中性粒细胞胞外杀菌网络（Nets）是中性粒细胞对抗入侵病原体，特别是hvKP的主要抗菌机制之一。不过多项研究表明，T2D患者虽然产生很多Nets，却更容易受到hvKPs感染。

近日，北京大学人民医院检验科王辉教授课题组的一项研究表明，T2D患者中NETs介导的杀菌能力降低，并不是因为对CR-hvKP的捕获失败所致，而与NETs引起的表面损伤有关。该研究发表在《Virulence》。

中性粒细胞在控制CR-hvKP感染中起着重要的作用，发生感染时，中性粒细胞被迅速地吸引到感染部位，并通过细胞内吞噬和Nets来清除侵入的病原体。在许多以前的研究中，hvKP菌株已被证明对吞噬有很高的抵抗力。该研究也发现，CR-hvKP很少被中性粒细胞吞噬，在正常人和糖尿病患者中，中性粒细胞的吞噬作用显著减弱。

为了解释糖尿病中性粒细胞的细菌杀伤受损，研究人员探究暴露于细胞外CR-hvKP的Nets的作用。该研究通过临床来源的CR-hvKP菌株，结合NETs复合物检测、吞噬试验、NETs杀伤试验和免疫荧光试验以及扫描电镜试验，在T2D的背景下研究NETs在hvKP感染中的作用。

结果发现，与健康对照组相比，从T2D患者分离的中性粒细胞表现出NETs形成的增强，表明T2D中受损的NETs介导的杀伤作用并不是由NETs形成减少所致。此外，该研究还证明NETs活性的降低不是由于CR-hvKP的捕获失败所致，而可能与T2D患者NETs引起的表面损伤有关。

总之，该研究数据为T2D中针对CR-hvKP的先天性免疫应答缺陷提供了新见解。

文章链接：

https://www.tandfonline.com/doi/full/10.1080/21505594.2020.1809325

第96期前沿报道到此结束