基于ATP生物发光法的微生物数量快速检测技术的研究进展

随着人们生活质量的提高，食品安全、卫生消毒监测与环境治理等行业越来越受到人们的重视[1-2]。在食品与卫生行业，细菌数量通常是其质量评价的重要标准；而在环境领域，活性污泥中微生物的活性是反映污水处理系统性能优劣的重要依据。传统的微生物数量检测方法一般采用平板计数法，具有检测准确度高、化学试剂用量较少等优点，但存在测定周期长、耗时耗力的缺点，难以满足当前快速、高效检测的分析要求。近年来，以腺嘌呤核苷三磷酸(adenosine triphosphate，ATP)为媒介的检测方法正以快速、灵敏、操作简便等优势在食品、医疗、废水处理等领域获得广泛应用。如食品行业中的灭菌评价及乳制品的细菌数测量；医疗行业中的器械消毒、药品成品检测及医疗室内空气污染评价等；而在废水处理领域中，ATP可表征微生物的活性、代谢水平及污水处理系统的运行状态；Chen等研究结果也表明，微生物降解污染物的过程中，微生物细胞内ATP的含量与污染物的去除效果间存在线性关系[3-5]。

ATP广泛存在于一切活的生命体中, 为机体组织细胞提供所需能量[6]。据报道，每个活的微生物细胞中的ATP含量基本相同，一般为5×10−16−5×10−15 g[7]，因此，在实际应用过程中可通过检测ATP的含量来判断微生物数量[8-9]。目前，ATP的检测方法包括层析法、电泳法与光学分析法。其中，光学分析法中的ATP生物发光法因其对微生物检测具有快速、简便、高灵敏度的优点[10]，逐渐在各行业的微生物检测中受到重视。然而，ATP生物发光法的检测结果准确性易受到一些因素的影响，如溶液pH对反应体系的影响、荧光素酶的稳定性不高、提取剂对反应体系具有抑制作用、ATP生物发光法的检测灵敏度低或检测限值较高等，进而影响反应体系中ATP发光值的测量。本文简要介绍常见微生物量的检测方法、ATP生物发光法的发展历程、原理及检测步骤，重点论述ATP检测技术的影响因素及应用现状，并对ATP生物发光法的发展趋势进行展望。

目前，国内外检测微生物数量的方法多种多样(表 1)，以传统平板菌落计数法为例，该法通常需在37 ℃恒温培养24−48 h获得结果，而检测酵母及霉菌等需要4−7 d。由此可知，传统微生物检测法操作烦琐且用时长，已难以适应不同行业微生物数量快速检测需求；其他方法如血细胞计数板计数法、膜过滤计数法等具有操作简便、结果较准确的优点，但上述方法并不适用于复杂体系(如污泥、沉积物等)中微生物数量的检测；荧光原位杂交-流式细胞术、高光谱成像技术等能快速、准确测定，但操作烦琐、易受测量条件影响。如今，微生物数量的检测方法逐渐朝着高科技智能化方向发展，这些方法共有的特征就是快速、简便和准确。与传统检测方法相比较，ATP生物发光法具有无需培养、操作简便快速等优点，而且检测结果与平板菌落计数有较好的相关性[23]，更适用于微生物量的快速检测，在不同行业或领域(食品卫生、医学、生态环境科学等)中获得广泛应用。

生物发光的研究始于1885年Dubois的实验，他首次证实荧光素酶与荧光素之间产生的化学反应能引起生物发光现象[24]；ATP生物发光法的反应机理最早由McEIroy和Strehler[25]于1949年提出，他们证实ATP含量与荧光发光强度成正相关。ATP生物发光技术起源于20世纪70年代，是以ATP为检测对象的一种生物检测方法。1983年，Moyer等提出所有微生物细胞内都存在ATP且含量一定，可通过细胞内源性ATP的含量来表征细胞活性及活细胞的数量[26]，ATP生物发光技术可用于细胞活性的检测[27]。20世纪80年代，ATP检测仪由英国人首先研制并逐步发展到欧洲、美国和日本[28]。20世纪末ATP生物发光技术引入中国。此后，ATP生物发光技术不断建立和完善，并开始研制定量测定的检测仪，目前已广泛用于食品卫生、医学、生态环境科学等重要领域。

ATP生物发光法的主要原理为[29]：在有氧环境中，荧光素在荧光素酶、Mg2+的催化作用下与ATP发生反应生成荧光素-AMP复合体并释放出焦磷酸(pyrophosphoric acid，PPI)；荧光素-AMP复合体在O2的作用下，进一步生成氧化荧光素并释放出CO2、H2O和AMP；最终，激发态的氧化荧光素回归基态，发出光子(图 1)，光子数量可换算成ATP的含量[30]。ATP生物发光法检测步骤主要包括样品中ATP的提取、荧光素-荧光素酶溶液的添加与反应、生物发光值检测3个部分[31]，通过ATP生物发光法标准曲线计算，进而反映样品中微生物的量。

ATP生物发光的主要反应物质包括荧光素、荧光素酶和ATP提取剂。尽管ATP生物发光法具有操作简便、反应迅速和灵敏度高的优点，但其检测灵敏度易受到诸多因素的影响。ATP生物发光技术要求细菌浓度不低于103 CFU/mL，因此部分细菌检测需进行过滤或预培养以满足卫生学要求[32]。国内外就如何提高ATP生物发光技术的检测灵敏度开展了大量工作，目前已报道的影响生物发光体系的因素主要包括样品处理时间、荧光素酶活性、提取剂种类、反应体系的温度、反应时间与缓冲液pH等。

ATP生物发光法主要应用于测定微生物的量，而待测样品中的非微生物ATP，如游离ATP及动物体细胞中的ATP是影响测量结果准确性的主要因素。目前，降低游离ATP的方法主要包括过滤法(采用滤膜器对样品进行过滤，然后清洗滤膜以去除游离ATP)和酶解法(利用酶裂解去除游离ATP)，但这两类方法均不能完全去除游离ATP[33]。李利霞等[33]提出了使游离ATP沉淀及利用多种ATP水解酶水解ATP，并确定了最适合游离ATP的去除方法，为之后的精准测量提供了较好的思路。近年来，应用较广的非微生物ATP去除的方法是利用非离子表面活性剂Triton X-100与三磷酸腺苷双磷酸酶(adenosine triphosphate double，Apyrase)结合的方法，作用原理是：Triton X-100不破坏细菌细胞壁，主要破坏哺乳动物细胞(体细胞)膜，促进胞内ATP的释放，然后释放的胞内ATP被Apyrase耗尽而去除；随后，Apyrase被灭活，细菌细胞同时被表面活性剂提取，释放胞内ATP进行定量检测[34]。尽管每个细菌细胞中的胞内ATP约为2 amol (10−18 mol)，但哺乳动物细胞的胞内ATP含量要比细菌胞内ATP高出104−105倍[35]。因此，在大量哺乳动物细胞或大量胞外ATP存在的样品中检测相对较少的细菌细胞ATP含量十分困难[36-37]。鉴于此，Pavankumar等开发了一种重组Shigella flexneri Apyrase (RSFA)，并与5种商业化酶(马铃薯脱酪酶、酸性磷酸酶、碱性磷酸酶、己糖激酶和甘油激酶)的ATP消耗潜力进行了对比，结果显示，RSFA可完全消除细胞外ATP和ATP的复合物，甚至在尿液和血清等生物样本中也显示出优越的活性[38]。

样品中的细菌数量是影响ATP生物发光法测量准确性的重要因素之一。传统的ATP生物发光法要求ATP的含量不低于10−16 mol，其检测限值须达到103−104 CFU/mL[39]，在医疗器械清洁水平检测、食品安全等领域该方法难以直接应用。常规的解决方法包括过滤浓缩法、前培养法及利用PCR或荧光原位杂交技术[40]，虽具有准确性高的优点，但存在耗时长、难以实现快速检测等缺点，不易于推广使用。

研究证实，ATP扩增技术具有灵敏度高与快速检测的优点，可有效克服样品中微生物ATP含量低而导致检测结果不准确的难题。ATP扩增技术有两条扩增路线[41]，即焦磷酸(PPi)扩增与AMP扩增(图 2)。针对AMP扩增技术，Satoh等[42]通过利用腺苷酸激酶(ADK)催化ATP与AMP反应生成2分子的ADP，再利用聚磷酸激酶(PPK)催化2分子ADP与2分子磷酸烯醇丙酮酸(PEP)生成2分子ATP，以此类推，最终可实现对细菌的CFU进行测量。Sakakibara等[43]通过扩增技术并利用磷酸腺苷脱氨酶消除内源性干扰，无需培养就可检测出啤酒中的大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、短乳杆菌，检测限达到了1 CFU/mL。对于PPi扩增，常超等[39]利用基于PPi扩增途径的ATP生物发光法检测了乳制品中微生物的含量，当腺苷酰硫酸(adenosine-5′-phosphosulfate，APS)浓度为10 µmol/L、ATP硫酸化酶(ATP sulfurylase，ATPS)活力为0.15 U/mL、反应pH 7.8时，ATP生物发光法的灵敏度提高了10倍。Lee等[41]将ATP与荧光素反应生成的产物PPi与AMP同时进行扩增，形成指数型扩增，可检测至10 CFU/mL细菌。由此可知，在要求较高的医疗环境微生物检测应用领域，ATP扩增技术具有良好应用前景。

ATP生物发光法中的ATP提取剂主要有以下特点：(1) 可快速杀死活细胞并破碎细胞膜以获得最大ATP的量；(2) 使ATP水解酶(Apyrase)失活并且不影响ATP的性质；(3) 不影响或轻微影响荧光素酶的活性。

目前，提取微生物ATP的方法有很多，主要包括缓冲液煮沸法[44]、超声[45]、微波[7]、各种酸碱、表面活性剂及一些有机溶剂[46]等(表 2)。现阶段针对液体样品应用较多的提取剂主要包括三氯乙酸(trichloroacetic acid，TCA)及表面活性剂这两类，而针对土壤中ATP的提取，则是二甲基亚砜(dimethyl sulfoxide，DMSO)[57]的应用较多，并且通过DMSO与磷酸、尿素、乙二胺四乙酸(ethylenediamine tetraacetic acid，EDTA)等的联合应用，可增强土壤ATP的提取效果。为了消除TCA对荧光素酶的抑制作用，一般使用的试剂有环糊精(β-CD)、二乙氨乙基胆固醇、磷脂酰胆碱[48]及二乙氨基乙基葡聚糖(diethylaminoethyl-dextran，DEAE-DX)[45]。现阶段的研究结果表明，阳离子表面活性剂苯扎溴铵(benzalkonium bromide，BAB)和苯扎氯铵(benzalkonium chlorides，BAC)对菌类的提取效果较好，并可通过添加相应的解抑制剂来减少其对ATP生物发光系统的抑制作用，因此可将BAB和BAC作为菌类ATP提取的主要试剂[58-60]。值得注意的是，BAB与BAC在污水厂活性污泥ATP提取中的应用较少，此类表面活性剂对活性污泥ATP提取效果的影响有待系统深入研究。

当前，无论基于何种荧光素的发光体系，其催化反应都是由ATP、荧光素酶、荧光素、二价金属离子等共同完成，荧光素酶的催化起主要作用。因此，优化荧光素酶的反应条件是必要的。目前已知的荧光素酶活性影响因素包括离子浓度、pH、温度及制备方法等。

Gilles等[61]研究了盐和缓冲液中的离子对荧光素-荧光素酶系统测定三磷酸腺苷的影响，对于荧光素-荧光素酶的反应体系来说，阴离子比阳离子抑制作用更强且Ac− < Cl− < I− < ClO4−。阳离子在ATP生物发光法反应体系中一般起催化作用，如Mg2+主要与ATP结合提高ATP与酶分子的结合能力[62]。此外，其他二价金属离子如Mn2+、Ca2+与Mg2+有相同作用，并且具有较大的浓度范围，但某些金属离子如Hg2+、Sn2+和Cd2+对荧光素酶活性有明显抑制作用[63]。

荧光素酶的制备方法显著影响荧光素酶的活性，主要体现在荧光素酶活性改变与荧光素酶活性保护两方面。改变荧光素酶活性一般采用遗传突变或定点突变的方法[64-66]。如Dale等[67]利用虫荧光素酶突变分析证明缓慢向酶供应荧光素腺苷酸增加底物荧光素腺苷酸发射的光子总数，突变型萤火虫荧光素酶发射的光子总量平均比野生型萤火虫荧光素酶发射的光子总量高50倍。利用PLG2新型荧光素酶，Branchini等[68]研究了嵌入酶PpyLit的增强催化性能，发现嵌入酶具有比原P. pyralis酶高2.9倍的催化效率和高1.4倍的生物发光量子产率，并不是简单的加法。

荧光素酶的保护主要是针对荧光素酶对温度及pH的敏感性所选的保护剂与适配离子浓度进行酶活性的保护[69]。如刘艳杰[70]在37 ℃、pH 7.8时，通过单因素试验获得几种荧光酶保护剂的最佳用量：BSA、DTT、蔗糖、甘油与海藻糖的最佳浓度分别为30 μg/mL、0.6 mmol/L、10%、30%和0.10 mol/L。将上述最佳浓度的各种保护剂混合，以此提高荧光素酶的储运稳定性。罗展浩[71]对北美萤火虫荧光素酶的纯化与特性进行了研究，并考察了荧光素酶一系列的保护剂与发光增强剂的配比，为今后的规模化生产奠定了基础。

目前，荧光素酶活性的长效保持(尤其是常温条件下酶活性的维持)仍是一大挑战，解决酶活性长效保持这一关键技术问题将有效推动该方法在不同行业的大规模应用。

消毒剂残留、样品性质、提取剂颜色及检测设备的差异均会对ATP生物发光法检测结果造成不同程度的影响。在医疗消毒和其他环境表面清洁度的研究中，ATP生物发光法易受到表面消毒剂残留的影响，从而出现假阳性或假阴性的结果[72]。在评价医院清洁度时，发现材料表面的物理性质也会影响ATP的积累[73]；而通过对重症监护室消毒后的环境表面监测，发现不同的检测仪所测的ATP值差异也较大[74]。此外，提取剂的颜色对ATP检测也具有干扰作用。如冯敏等[75]研究表明，添加柠檬黄溶液的对照组与实验组(未添加柠檬黄)结果出现偏差，而且色素的含量越高偏差越大，颜色对光子的淬灭作用越强。

综上所述，ATP生物发光法检测微生物ATP含量过程中受到众多因素的影响，现有研究成果为提高微生物ATP含量的准确检测提供了一定的理论依据与方法参考，实际应用过程中，应结合行业特征与检测要求分别制定不同检测策略，从而实现不同行业中微生物ATP的有效检测。

近年来，ATP生物发光法应用广泛，前景广阔。在食品方面，ATP十分适合食品行业的危害分析和关键点控制(hazard analysis critical control point，HACCP)体系中的细菌学检测，广泛应用于食品生产线、食品器件的清洁度评价，以及奶制品、蔬菜与调味品的灭菌效果；在医疗方面，主要用于医疗器件的消毒效果评价、医疗室的空气洁净度评价，以及药敏性实验的结果评价；在废水生物处理工艺中，ATP生物发光法主要通过测定微生物量来判断废水的可生化性与评价工艺运行性能。此外，在土壤、文件资料的真菌污染等方面也有相关应用案例见诸报道(表 3)。

ATP荧光检测仪基于萤火虫发光原理，利用“荧光素-荧光素酶体系”快速检测ATP。国内ATP荧光检测仪的研制较晚，但随着技术的提高及需求的日益上升，ATP检测技术已经成熟，相应的ATP检测仪产品正在逐渐成熟，并开发了便携式ATP检测仪。目前，市场上已有了较多的手持式ATP荧光检测仪，具有检测快速(通常只需要5−20 s)、操作方便等优点。其已经在食品、医药卫生、医药、日化、造纸、工业水处理、国防以及环保、水政、海关出入境检疫及其他执法部门等领域。2007年，龚大江等[98]设计并开发出用于现场微生物快速检测的手持式ATP荧光检测系统，ATP检测极限达1×10−13 mol，单次检测不超过20 s，可记录1 000条检测结果。周爱玉等[99]设计的手持式ATP生物荧光检测仪检测限能达到1×10−14 mol，检测时间为10 s，仪器响应值与标准ATP样品浓度在对数坐标下呈线性相关，相关系数达到了0.990 2。董曼曼等[100]对目前市场上常见的10家公司的手持式ATP荧光检测仪的主要性能指标，包括线性、重复性、检出限及衰减率等进行检测，结果显示各项性能指标均达到要求的产品只有3家公司。ATP快速检测仪还存在检测灵敏度不高、精密度差等缺点，而且不同公司生产的仪器的线性范围不同，因此测定值不能进行相互比较。在今后的研究中，除了提高仪器灵敏度、精准度等，还需要有制定相关标准，便于相互参考分析。

虽然ATP快速检测仪能提供快速便捷的ATP检测，但污水处理系统中ATP的检测要求能及时、连续监测微生物的活性变化以指导污水处理系统的稳定运行，便携式ATP快速检测仪器难以满足需求。最近，LuminUltra Technologies公司推出了BugCountⓇ在线ATP检测仪，在工业循环水、冷却塔、膜法回用水、反渗透除盐等水处理过程中实现了微量/痕量微生物的在线检测。然而，活性污泥工艺中的样品十分复杂，如何排除活性污泥样品检测过程中各种干扰物质的影响，强化活性污泥微生物细胞ATP的提取效果与ATP检测效率，实现活性污泥中ATP的实时、精准检测，目前国内外几乎未见报道。本实验室针对活性污泥等复杂样品，研制出了活性污泥ATP在线检测设备，优化了ATP提取剂组成，减小了活性污泥样品检测过程中各种干扰物质的影响，强化活性污泥微生物细胞ATP的提取效果与ATP检测效率，实现活性污泥中ATP的实时、精准检测，也可实现水质和活性污泥中微生物数量的在线检测[101]。

综上可知，尽管ATP快速检测仪的研制使得ATP的检测更为便捷，但该方法仍不能满足活性污泥工艺等复杂体系中微生物ATP含量的实时、动态检测需求。此外，使用ATP生物发光法通常需要具有高素质人员和昂贵设备的专业实验室，检测设备仍然是限制其广泛应用的关键因素。随着ATP检测系统的自动化性能不断改进和提高，适用于现场ATP检测的仪器研制是必然趋势，基于ATP生物发光法的在线检测仪器设备的研发与应用是一个十分有潜力的发展方向。

目前，ATP生物发光法已在食品、医疗、卫生消毒及生态环境科学等领域中微生物的检测方面获得了广泛发展与应用，在食品安全、医疗消毒与废水处理效果评价方面发挥了重要作用。尽管该方法对于微生物的检测具有快速、灵敏、广谱等优点，但其易受到各种因素(样品性质、荧光素酶活性与稳定性、提取剂与解抑制剂等)的影响，检测结果的准确性仍存在挑战。为提升ATP生物发光法检测结果的准确性与适用性，以下几方面的问题值得关注：

(1) 整个ATP生物发光法检测体系中，荧光素酶各试剂间的相互作用对检测结果影响较大，然而目前的研究主要集中在对单一提取剂或荧光素酶的优化与调整方面。因此，在今后的研究中，应根据样品的性质与特征，更加注重整个ATP发光反应体系中提取剂、解抑制剂、荧光素酶活性等的有机组合与优化，以进一步提高检测的准确性与灵敏度。

(2) 对于微生物含量较少的样品，现有的ATP扩增技术基本能满足检测要求，但ATP扩增技术本身存在内源性污染从而产生背景干扰，今后需根据内源性污染产生的来源采取相关措施解决背景干扰的问题。

(3) 目前各行业针对微生物数量检测缺乏明确的计量体系，同时不同检测设备的检测限度存在差异，而且实际应用中均需要与平板计数法等标准计数法进行比对，效率较低。因此，未来各行业可根据实际情况推行单独的行业计量体系。

(4) 在环境治理方面，ATP生物发光法的应用主要用于反映活性污泥工艺中微生物的活性，进而判断活性污泥系统的运行状态。然而现阶段的ATP检测仪器主要以实验室与便携式为主，缺乏实时在线的监测手段，难以对活性污泥系统运行状态起到实时监测与预警作用。因此，在当前微生物量快速、简捷和准确检测的要求下，基于ATP生物发光法的原位在线监测仪器设备的研发与应用是一个十分有潜力的发展方向。