WB做了那么久 看了这篇终于把蛋白电泳的原理搞懂了！

什么是聚丙烯酰胺凝胶电泳，什么是蛋白质电泳？

PAGE是一种技术，根据蛋白质等大分子的电泳迁移率（即分析物向相反电荷的电极移动的能力）来分离它们。在PAGE中，这由分子的电荷、大小（分子量）和形状决定，分析物通过聚丙烯酰胺凝胶中形成的孔隙移动。

与DNA和RNA不同的是，蛋白质的电荷根据所加入的氨基酸而不同，这可能影响它们的运行方式。氨基酸串也可能形成二级结构，影响它们的表面大小，从而影响它们如何通过孔隙移动。因此，如果需要更准确地估计蛋白质的大小，有时最好在电泳前将其变性，使其线性化。

聚丙烯酰胺形成的孔比用于琼脂糖凝胶电泳的琼脂糖的孔小。这使得它更适合于在大型多核苷酸DNA或RNA片段上分离蛋白质，并允许分离相对较小的蛋白质。因此，当人们提到「蛋白质电泳」时，他们最经常提到的分离技术是PAGE。

一.SDS PAGE与Native PAGE的简介

根据分析的目的，PAGE可以在变性（SDS-PAGE）或非变性(Native PAGE)的条件下运行。

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SDS-PAGE

阴离子洗涤剂十二烷基硫酸钠（SDS）与热量以及有时与还原剂结合使用，在电泳分离前使蛋白质变性，这一过程被称为SDS PAGE。                 

热力破坏了保持二级和三级结构的氢键，而还原剂，如β-巯基乙醇，则裂解二硫桥。蛋白质被线性化并与SDS复合，因此所有的蛋白质都具有相似的质量电荷比。这就消除了结构和电荷的影响，蛋白质仅根据其分子量的不同而被分离（图1）。通常用于分离5~250 kDa的蛋白质。

图1 | 用于SDS PAGE的蛋白质的线性化。二硫键被β-巯基乙醇还原，而SDS则否定了质量-电荷比的差异，这样蛋白质就可以根据分子量进行分离。

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Native-PAGE

在Native PAGE[2]中，这些键被保留下来，保留了蛋白质的高阶结构。因此，蛋白质在凝胶中的分布主要受蛋白质的电荷（由其氨基酸序列和翻译后修饰决定）和分离的pH值的影响，而不是它的kDa大小。

然而，它允许研究人员分析自然或「原生」状态的蛋白质。这在分析结合蛋白或复合物时可能是可取的，例如，当它们的生物活性保持不变是很重要的。由于这里的目的是保持蛋白质的自然状态，所以在样品制备中不使用SDS、还原剂和热量，也可以使用较低的电压进行分离。

二.聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）是如何工作的？

PAGE的基本原理是通过电流使分析物通过聚丙烯酰胺凝胶的孔隙来分离它们。为了实现这一目的，通过添加过硫酸铵（APS）使丙烯酰胺-双丙烯酰胺混合物聚合（聚丙烯酰胺）。在四甲基乙二胺（TEMED）的催化下，该反应形成了一个类似于网状的结构，其中有孔隙，分析物可以通过它移动（图2）。

图2 | 丙烯酰胺的聚合和交联。TEMED催化的APS导致了丙烯酰胺的聚合和交联。丙烯酰胺成分的总浓度和丙烯酰胺与双丙烯酰胺的比例会影响凝胶的孔径大小，从而影响可解析的蛋白质尺寸范围。

凝胶中包含的丙烯酰胺总量的百分比越高，孔径就越小，因此能够通过的蛋白质就越小。丙烯酰胺和双丙烯酰胺的比例也会影响孔径大小，但这通常保持不变。较小的孔径也会降低小蛋白质在凝胶中移动的速度，提高它们的分辨率，防止它们在电流作用下迅速跑到缓冲液中。

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蛋白分子在凝胶电泳中的工作原理示意图

图3 | 蛋白分子在凝胶以及电场作用下的工作原理图

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那么 浓缩胶是如何工作的呢？

浓缩胶的目的是将需要分离的蛋白质混合物聚集在浓缩胶和分离胶的分界线上。因此，所有的蛋白质首先被压缩累积在分界线上，然后，在大约同一时间进入分离凝胶，无论蛋白质的大小是多少。

图4 | 蛋白分子在浓缩胶（上层胶）的工作原理图当施加电压后，甘氨酸分子（最简单的氨基酸）和Cl-开始通过凝胶向正极迁移。由于甘氨酸分子在浓缩胶中以两性离子的形式存在，其电泳迁移速率非常慢。氯离子比甘氨酸分子迁移得更快，产生了不平衡的正反离子区域，从而在氯离子和甘氨酸离子之间形成了很大的电压梯度。 在甘氨酸分子（最慢的)和氯离子(最快的）之间存在样本混合物中的所有蛋白质（图04）。样品分子在氯化物和甘氨酸之间中间迁移，逐渐被压缩成非常薄而清晰的蛋白层，方便后面更好的蛋白分离。在这个阶段，样本蛋白分子处于两种离子（后面的甘氨酸和前面的氯离子Cl-）之间，在浓缩胶和分离胶之间形成薄薄的一层。

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蛋白质从浓缩胶到达分离胶界面时发生了什么？

图5 | 蛋白分子在分离胶（下层胶）的工作原理图

当到达分离胶时，pH值增大，孔径急剧减小。在更高的pH值下，甘氨酸分子不再以两性离子的形式存在，它们在这个阶段就会电离，并开始比在浓缩胶中时迁移得更快。氯离子Cl-很快就会向阳极迁移。因此，一旦蛋白质不堆积，甘氨酸分子很快难以束缚样品蛋白质分子，蛋白质分子开始在电流的作用下按照分子量大小自由的分离。

三.SDS-PAGE凝胶电泳的主要步骤：

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先制备和灌注分离胶

制备分离胶需要两块玻璃板，一个短板，一个长板，将两块玻璃板夹在制胶架上（图6），灌胶完成后，加异丙醇赶走凝胶上面的气泡。关于灌胶的高度，这可以通过放置梳子确定，一般大约梳子下1cm,用笔标记制胶的高度，开始灌胶，加异丙醇封胶。等待胶凝固后，倒掉上层异丙醇，用吸水纸吸干异丙醇。

 图06: SDS PAGE制胶架

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再制备和灌注浓缩胶

当下层的分离胶凝固后，就可以开始直接加积层胶至玻璃最上层，然后插入梳子。等待积层胶凝固后，小心拔出梳子，避免用力过猛破坏了凝胶上样孔。

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加样至凝胶孔中

用微量移液器向凝胶孔中依次加入蛋白marker和样本，蛋白marker是已知蛋白条带分子量的预染蛋白，可作为标定蛋白大小的标尺参考。然后依次点入其他样本至凝胶孔中。每孔的样本上样量保持一致（主要是质量一致），加样时要小心，确保不损坏加样孔的尺寸或不将样品溢出孔外，更不能把样本加到孔外。在这个阶段，蛋白质的样品是蓝色的，因为在制备样品时使用了电泳指示剂染料--溴酚蓝

 图07:上样

04

设定电泳条件，启动电泳

将凝胶和玻璃板浸入电泳缓冲液中后，就可以开始设定电压和时间，开始电泳了。当示踪染料到达或穿过凝胶时，停止电泳。

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分析蛋白条带

用去离子水冲洗凝胶3-5次，以去除SDS和缓冲液。它可能会阻碍染料（0.1%考马斯蓝）与蛋白质的结合。然后将凝胶浸泡在考马斯蓝染液中染色，室温，摇床孵育。一般蛋白质条带会在几分钟内开始出现，但完全染色大约需要1小时（图07）

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