肝脏里面也有细菌？还能调节免疫？这你信吗？

  ——摘要——

  背景: 肠道微生物群形成局部和全身免疫。肝脏与肠道非常相似，密集分布着无数的先天和适应性免疫细胞，这些细胞在生理稳态中至关重要，并通过门静脉循环在宿主和环境之间起到选择性屏障的作用。虽然细菌从其他部位转位到肝脏已被报道，内源性肝微生物组尚未被检查。我们假设肝脏内存在调节肝脏免疫的微生物。

  方法: 无菌采集C57BL/6J小鼠的肝组织和接受肝切除术患者的正常肝旁组织进行16S rRNA测序。实验用由万古霉素、氨苄青霉素、新霉素和甲硝唑组成的口服抗生素治疗小鼠，或单独或联合使用。用肝脏组织免疫组化、流式细胞术和分离的肝脏非实质细胞的单细胞RNA测序来量化和表征对照组和抗生素治疗小鼠的肝脏免疫浸润。

  结论: 在小鼠和人类的肠道中，肝脏中存在着一种活跃的微生物群落。拟杆菌门糖鞘脂NKT轴增强肝脏中的免疫细胞招募和激活。总的来说，我们的数据表明，内源性肝脏微生物群及其代谢产物在调节肝脏免疫和耐受之间的平衡方面至关重要，并可能为肝脏疾病和移植中基于微生物的治疗提供理论基础。

  ——实验设计——

  ——主要结果——

  1. 肝脏里存在微生物

  为了确定肝脏是否有微生物组，作者对正常小鼠肝组织进行了 qPCR。在肝脏中检测到微生物种群，尽管与肠道相比微生物种群数量较低; 肝脏微生物种群数量很容易区分于仅使用试剂的对照组(图A和图S1A，表S1)。16S FISH 和透射电镜显示肝窦腔内存在肝细菌，并被 Kupffer 细胞吞噬(图1B 和图S1B，C)。无菌小鼠没有检测到肝微生物组(图S1B)。同时成功地在需氧和厌氧条件下从无菌获取的肝组织中培养细菌(补充图1D)。为了鉴定肝脏微生物组的特征，我们对6周大的雌性小鼠进行了16S RRNA 测序。肝脏检测到5个不同的门类，其中Bacteroidetes (~50%)、Firmicutes (~25%)、Proteobacteria (~20%)和Verrucomicrobia (~4%)最多(图1C)。值得注意的是，蛋白细菌在肝脏微生物组中所占的比例是肠道的40倍，而Firmicutes在肠道中所占的比例是肠道的2倍。在属水平上，肝脏中Delftia和Coprococcus明显增多，而肠道中包括Lactobacillus，Ruminococcus和Clostridium在内的许多类群更为普遍(图1D，E)。利用线性判别分析效应大小(左撇子)评估支系丰度揭示了整个分类层次中肝脏和肠道之间微生物组成的差异(补充图1 E)。同时，作者成功地在需氧和厌氧条件下从无菌获取的肝组织中培养细菌(补充图1D)。

  图 1.肝脏微生物组与小鼠肠道不同。(A)使用qPCR在6周龄雌性WT小鼠的肠道和肝脏中测量细菌DNA含量。n = 5。**P < 0.01(B)FISH使用16S探针评估肝内微生物组的存在。显示代表性图像。比例尺：20 μm。(C)根据16S rRNA-Seq确定的相对(Rel.)丰度的平均百分比分配给肠道和肝脏门级的微生物群的分类组成。n = 10。**P < 0.01;P < 0.0001。(D) 显示日志的热图2-转化肝脏和肠道中最具代表性的细菌属的相对丰度。(E)基于16S rRNA-Seq的线性判别分析(LEfSe)在肝脏(蓝条)和肠道(红条)中发现了差异丰富的属。(F) 基于布雷-柯蒂斯相异矩阵的加权 PCoA 图。每个符号代表肝脏(蓝色)或肠道(红色)的样本。聚类由成对的PERMANOVA确定。x 轴和 y 轴表示变异百分比，省略号表示 95% 置信区间。(G)分析6周龄雌性WT小鼠的肝脏和肠道微生物组，以α多样性指标，包括观察到的OTUs，Chao1，ACE，PD以及Shannon和Simpson指数。**P < 0.01;P < 0.0001。(H–J)用FMT治疗无菌小鼠。将供体FMT浆液、受体肝脏和受体肠道中微生物群的分类组成分配到门(H)和属(I)水平，并根据16S rRNA-Seq确定α多样性测量(J)。n = 5。*P < 0.05;**P < 0.01;P < 0.001;P < 0.0001。

  2. 肝脏微生物群从肠道选择性获得

  首先，作者假设肝脏细菌的来源是肠道微生物群。为了验证这一假设，作者选择口服荧光标记的牙龈卟啉单胞菌，之后检测起在肠道和肝脏中的丰度。假设得到验证，牙龈假单胞菌易位到肝脏，线性回归分析表明，尽管胃和十二指肠中牙龈假单胞菌的丰度在时间上有所下降，但其在肝脏中的丰度仍保持稳定(图F)。

  为了测试肠道微生物是否会具有选择性，作者将来自特定无病原体(SPF)供体小鼠的粪便微生物移植(FMT)给无菌小鼠。在无菌小鼠中，FMT成功地将肝脏与肠道连接起来(图1H，I)。从遗传学的角度来看，FMT 的数据表明肝脏微生物组是由肠道选择性地给予的。

  3. 人类肝脏的微生物组不同于肠道

  在16S rRNA测序数据ß多样性分析中，人类微生物群与肠道分离聚集(图2A)。此外，与我们在小鼠中的发现类似，Bacteroidetes在肝脏中的数量明显多于肠道，而Firmicutes则较少(图2B)。同样，基于OTU、chol、ACE和PD的a-多样性分析显示，与肠道相比，人类肝脏中的微生物丰富度明显较低，基于Shannon和Simpson指数的均匀度也有所下降，这再次与我们在小鼠中的发现相似(图2C)。综上所述，这些数据表明，人类肝脏中存在一种富含Proteobacteria的微生物群，这与肠道不同。

  图 2. 肝脏微生物组与人类肠道不同。(A–C)用16S rRNA-Seq分析来自26名患者的匹配肝脏和粪便标本。显示了基于Bray-Curtis相异性矩阵(A)的加权PCoA图，基于相对丰度平均百分比(B)分配到门级的微生物群的分类组成以及α多样性测量(C)。*P < 0.05;P < 0.0001

  4. 肝脏微生物组因年龄、性别和环境影响而不同

  为了确定肝脏的微生物组随年龄变化，作者对6-48周龄雌性小鼠的肝脏微生物组进行了比较分析。而6周龄小鼠肝脏中最丰富的门类是拟杆菌门和厚壁菌门，随着小鼠年龄的增长，这些门类减少，变形菌门变得最为丰富(图3A)。相比之下，拟杆菌类和厚壁菌类仍然是所有年龄段肠道中最丰富的门类(补充图2A，B)。在属水平，Pseudomonas和Delftia成为优势分类群在老龄小鼠的肝脏中(图3B)。Pcoa 显示了不同发育年龄小鼠肝脏微生物群落的明显聚集性(图3C)。此外，随着动物年龄的增长，肝脏微生物群落的丰富度和均匀度显著下降(图3D)。

  图3. 肝脏微生物组随年龄而变化。(A-D)我们通过16S rRNA-Seq比较分析了6，12，24和48周龄雌性小鼠的肝脏微生物组。根据相对丰度的平均百分比，将肝脏中微生物群的分类组成分配到门(A)和属(B)水平。基于Bray-Curtis相异性矩阵(C)的来自每个队列的加权PCoA图，并显示了与6周(D)相比α多样性测量的变化。n = 5/组。*P