一种鼻咽癌临床相关放射抗拒性细胞株的构建方法与流程

本发明涉及细胞生物学技术领域，具体是一种鼻咽癌临床相关放射抗拒性细胞株的构建方法。

背景技术：

受制于鼻咽结构的复杂性及鼻咽癌浸润性生长特性，放射治疗是主要的治疗手段。随着imrt等新技术的广泛应用，鼻咽癌的局控率明显提高，但仍有部分患者出现肿瘤复发，其中以t3和t4期患者为主，5年局部复发率达11.2％和18.9％。而复发鼻咽癌往往治疗效果欠佳，5年生存率仅为38％。

肿瘤细胞对放射线的抵抗是造成放疗后肿瘤残留及复发的主要原因之一。如何鉴别放疗抵抗的鼻咽癌患者，并进行针对性治疗是亟待解决的问题。

现有放射线诱导肿瘤细胞放射抗拒性方法，多选择以指数期作为照射时机，此时细胞活力最强，状态最好，干预措施能达到较好效果。早期研究常见的照射源是60coγ、139铯乖，随着直线加速器的普及，6mvx线成为主流。

在照射方法上，不同研究差异较大，在文献：庄喜兵，乔田奎，许国雄，等.放射抗拒lewis肺癌细胞系的建立[j]中华放射医学与防护杂志，2015,35(11)；805-808.doi:10.3760/cmaj.issn.0254-5098.2015.11.002.构建放射抗拒性lewis肺癌细胞株时采取了如下方法：6mvx线，照射野7*7cm，源靶距100cm；培养瓶朝上，上盖1.0cm补偿胶。文献：李海英,张力,吴建波,等.西妥昔单抗对人食管癌放射抗拒性细胞株kyse-150r放射敏感性的研究[j].中华放射医学与防护杂志,doi:2010,30(3):291-294.doi:10.3760/cma.j.issn.0254-5098.2010.03.016.在移除培养液后将培养瓶底朝上，表面盖1.5cm补偿胶再进行照射。该照射方法中，肿瘤细胞长时间脱离培养液，可能造成细胞损伤甚至死亡，因此需严格把控操作时间；同时由于瓶口朝下，残留的培养液可能流至培养瓶口，增加污染风险。

文献：吴波,王勇,朱杰,应申鹏,吕佳铭,熊华才,胡洁,胡炜.放射抗拒性肿瘤细胞株构建研究进展[j].中华放射医学与防护杂志,2018,12(11).doi:10.3760/cma.j.issn.0254-5098.2018.012.000.在我们的既往研究中，根据分割剂量、照射次数及不同分割剂量组合方式等因素的不同，归纳为4种典型照射模式：(1)常规照射模式；(2)反复照射模式；(3)梯度照射模式；(4)其它照射模式。在相同的总照射剂量下，常规照射模式由于分割剂量低，照射次数多，污染风险大，构建周期相对更长。而采取亚致死/较高剂量的反复照射模式由于在构建初期即给予较高分割剂量，而此时肿瘤细胞的放射抗拒性较低，因此需更长时间增殖恢复至指数期并接受下一次照射。梯度照射模式随着细胞株放射抗拒性增强而逐步提高分割剂量，较好地平衡了分割剂量和照射后细胞恢复至指数期时间，照射次数较常规照射模式少，因此更具优势。

文献：姚文虎，章龙珍，邱详南，张伟，李浩，覃朝晖.一种肺癌辐射抗性细胞株的构建方法.cn104962548a[p].2015.选择六孔板作为细胞载体，并采用了梯度照射模式，但该方法采用的分割剂量远超临床常规分割剂量，其构建的放射抗拒性细胞株特性不具有代表性，对临床实践指导意义不足。

综上所述，本发明提出了鼻咽癌临床相关放射抗拒性细胞株的构建方法，该方法采取的分割剂量贴近临床实践，能更好反映临床实际情况；采取梯度照射模式较其它3种照射模式更具优势。

技术实现要素：

本发明的目的在于提供一种鼻咽癌临床相关放射抗拒性细胞株的构建方法，以解决上述背景技术中提出的问题。

为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：

一种鼻咽癌临床相关放射抗拒性细胞株的构建方法，包括以下步骤：

步骤1、培养cne-2细胞；

步骤2、构建cne-2r细胞株：照射方法为：采用6mvx射线照射，照射野为10cm*10cm，源皮距为100cm，吸收剂量率为200cgy/min，将培养瓶瓶口朝上，并在瓶表面覆盖一层1.5cm厚的补偿胶，照射模式为：取指数生长期的cne-2细胞株，以0.5gy剂量照射五次，以1.0gy剂量照射五次，再以1.5gy剂量照射五次，每次照射后均将细胞株培养至指数期再进行下一次照射；

步骤3、以2.0gy剂量照射30次，每次照射后均将细胞株培养至指数期后再进行，总照射剂量75gy，此时依然存活的细胞停止放射处理，并继续培养传代15天，传代次数3次；

步骤4、对cne-2r细胞株进行分析验证，分析验证包括：对细胞形态学的比较、细胞生长情况验证、克隆形成实验、对细胞周期的分析以及细胞凋亡的检测。

作为本发明进一步的方案：培养cne-2细胞的方法为：用含10％胎牛血清、100ug/ml青霉素、100ug/ml链霉素的rpmi1640培养液培养，置于37℃、5％co2、饱和湿度孵箱内，隔天换液，0.25％胰酶消化传代，将细胞传代至指数生长期。

作为本发明进一步的方案：对细胞生长情况验证的方法为：使cne-2r/cne-2分别接受2.0gy照射，对照组不接受照射，照射后，在不同的时间间隔通过细胞计数法监测细胞生长情况，重复3次，绘制生长曲线。

作为本发明进一步的方案：克隆形成实验的方法为：对cne-2r/cne-2细胞株分别接受0-亚致死剂量的照射，设3个平行样，照射后继续培养若干天。

作为本发明进一步的方案：对细胞周期的分析的方法为：经0.25％胰酶消化收集细胞，制备单细胞悬液，在70％乙醇、-20℃条件下固定至少18h，采用pbs洗涤3次，以含5mg/mlrna酶、100μg/mlpi染液避光染色30min，用流式细胞仪检测，并重复3次。

与现有技术相比，本发明的有益效果是：本发明的鼻咽癌临床相关放射抗拒性细胞株的构建方法，采用不超过2.0gy的分割剂量照射，贴近临床实践，更能反映临床实际情况；相对于常规、反复及其他照射模式，采用梯度照射模式，在保证获得较强照射强度的条件下，较好地平衡了总照射剂量、照射次数及构建周期，构建周期较短。

附图说明

图1为本发明中cne-2细胞的培养的结构示意图。

图2为本发明中梯度照射的方法流程图。

图3为本发明中cne-2细胞的显微图。

图4为本发明中cne-2r细胞的显微图。

具体实施方式

下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

一种鼻咽癌临床相关放射抗拒性细胞株的构建方法，包括以下步骤：

步骤1、cne-2细胞的培养：如图1，将cne-2细胞置于含5％fbs的rp-mi1640培养液中，于37℃/5％co2细胞培养箱中常规培养，0.25％胰酶消化传代；

步骤2、cne-2r细胞株的构建：采用6mvx射线照射，源皮距为100cm，吸收剂量率为200cgy/min，培养瓶2上覆盖1.5cm的补偿胶1(模拟皮肤)，培养瓶2置于移床3之上，射线源4位于培养瓶2正上方，照射模式如图2，采用梯度照射模式，取指数生长期的cne-2细胞株，给予0.5gy剂量照射一次，培养至指数期后再次照射，待细胞株恢复至指数期时，取指数生长期的cne-2细胞株，以0.5gy照射五次，随后以1.0gy照射五次，以1.5gy照射五次，以2.0gy剂量照射30次，每次照射后均将细胞株培养至指数期后再进行下一次照射，总照射剂量75gy，此时依然存活的细胞停止放射处理，并继续培养传代15天，传代次数3次；

步骤3、cne-2r细胞株的分析验证，包括：

(1)、细胞形态学的比较，以鼻咽癌细胞cne-2为实验对象，按步骤2对其进行照射，进行细胞形态学比较，如图3和图4所示，显微镜下cne-2细胞形态较规则，呈片状生长，而给予照射后，细胞形态发生明显变化，其具体表现出形状不规则，细胞呈纺锤体状以及极性消失的现象；

(2)、细胞生长实验：cne-2r/cne-2分别接受2.0gy照射，对照组不接受照射。照射后，在不同的时间间隔通过细胞计数法监测细胞生长情况，实验重复3次，绘制生长曲线；

(3)、cne-2r/cne-2细胞株分别接受(0-亚致死剂量)的照射，设3个平行样，照射后继续培养若干天(至对照组多数细胞集落>50个细胞)。甲醛固定，giemsa染色后计算细胞数>50的细胞集落数。根据以下公式计算，绘制存活曲线(多靶单击模型和线性二次模型)；

克隆形成率：

细胞存活分数：

(4)、细胞周期分析：经0.25％胰酶消化收集细胞，制备单细胞悬液。70％乙醇-20℃固定>18h，pbs洗涤3次，以含5mg/mlrna酶、100μg/mlpi染液避光染色30min，流式细胞仪检测，实验重复3次；

(5)、细胞凋亡检测：取对数生长期的cne-2和cne-2r细胞，在培养箱培养24h，胰酶消化，离心收集细胞，用pbs洗涤2次后，重新制成单细胞悬浮液，细胞浓度至少106/ml，加入5ulannexinⅴ-fitc和5ul的pi，避光反应15min后，用流式细胞仪检测两组细胞凋亡情况。

对于本领域技术人员而言，显然本发明不限于上述示范性实施例的细节，而且在不背离本发明的精神或基本特征的情况下，能够以其他的具体形式实现本发明。因此，无论从哪一点来看，均应将实施例看作是示范性的，而且是非限制性的，本发明的范围由所附权利要求而不是上述说明限定，因此旨在将落在权利要求的等同要件的含义和范围内的所有变化囊括在本发明内。不应将权利要求中的任何附图标记视为限制所涉及的权利要求。

此外，应当理解，虽然本说明书按照实施方式加以描述，但并非每个实施方式仅包含一个独立的技术方案，说明书的这种叙述方式仅仅是为清楚起见，本领域技术人员应当将说明书作为一个整体，各实施例中的技术方案也可以经适当组合，形成本领域技术人员可以理解的其他实施方式。