猪场必看：非瘟快检操作指南（视频）+快检技术18问

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这里可以输入简单的图片描述

PCR技术发展历史如何？

发展历程

所谓荧光定量PCR技术，利用荧光信号的变化实时检测PCR扩增反应中每一个循环扩增产物量的变化，通过Ct值和标准曲线的关系对起始模板进行定性/定量分析。

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荧光定量PCR检测方法有什么特点？

Ø 是可以替代病毒分离鉴定的一种灵敏、特异、快速的ASFV检测技术

Ø 同时，相比于抗原检测技术，如酶联免疫吸附试验（ELISA）和直接荧光抗体检测（FAT）具有更高的敏感性和特异性

Ø 被认为是ASFV核酸检测的金标准，被用在OIE所有的区域性参考实验室

Ø 对于特急性、急性或亚急性ASF感染病例，PCR是首选的检测技术

Ø 需要注意的是，PCR的高度敏感性使其容易发生交叉污染，应该采取适当的预防措施来坚守和控制污染风险的发生。

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官方推荐的非洲猪瘟检测方法有哪些？

如上所示，目前可用的诊断技术可通过综合病毒和抗体检测来确诊ASF。实时荧光PCR是应用最广泛的病毒学诊断技术，可敏感、特异、快速的实现ASF核酸的检测。

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国家批准了哪些试剂盒？

据悉，共有48个企业共计160个产品申报非瘟跨快速检测试剂盒，2019年6月11日中国动物疫病预防控制中心公布了结果，最终通过了26家企业的34个产品，绝大多数通过的试剂盒属于荧光定量PCR类，这也侧面说明该技术的成熟性。

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快检试剂盒应用范围有哪些？

最关键的也是大家容易忽略的是应用范围：猪血液和猪组织样品快速检测。单列一条，说明它的重要性。很有用户在使用的时候往往陷入这样的误区，期望快速检测试剂盒能够替代实验室检测，比如环境样本检测和某些病毒含量极低的样品。我们要清楚，快速检测试剂盒并不能完全取代专业实验室。

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什么是CT值？

可以通俗地理解，在一定范围内，CT值越低，说明待检样品浓度越高；CT值越高，说明待检样品浓度越低。CT值高出一定范围，说明样品为阴性。具体参照各试剂盒说明书。

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快速检测试剂盒有哪些组成部分？

组成：

ASFV PCR反应液

样本稀释液

混合酶液

ASFV 阳性对照

阴性对照

说明书

不同类型的试剂盒略微有些差异。

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市售非瘟快速检测有哪几种？

根据分装与否和提取与否这两个指标，市场上可以看到四种不同的快速检测试剂盒，这几种试剂盒本质上没有大的差异，操作方面有所体现。不同的用户群体可以根据情况进行选择。

试剂盒1：预分装+免提取；

试剂盒2：不分装+免提取；

试剂盒3：预分装+常规提取；

试剂盒4：不分装+常规提取。

简要介绍如上面图表所示。不同用户有不同的追求目标，对于血液和组织样本来说，这四种试剂盒都能满足检测需求。详细来讲，四种试剂盒形成四种检测方案，具体如下：

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“预分装+免提取”检测方案是什么？

这就是采用非洲猪瘟病毒荧光PCR快速检测试剂盒（预分装+免提取）的操作方案

从包装明细可以看出，也就是免提取和预分装的组合。主要特点体现在两方面，一是待检样本不用大型仪器来提取核酸，只需用样本稀释液和样本裂解液进行处理，即可获得反应模板；二是试剂盒的组成，除了阳性对照和阴性对照外，其他如引物、探针、酶、反应液等所用试剂提前装在了小管中，这样操作时就不用一样一样去加了。

简而言之，帮助操作者简化了几个步骤，也避免了漏加或多加等失误现象。

这也是最为流行，广受用户喜欢的一种检测方案。

不同类型样本检测样本的操作过程如下

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“不分装+免提取”试剂检测方案是什么？

这就是采用非洲猪瘟病毒荧光PCR快速检测试剂盒（不分装+免提取）的操作方案

如果你看懂了上面一种试剂盒的介绍，现在应该就一目了然了。和预分装的相比，差异就在于多了一管混合酶液。

其他操作步骤同上类似。

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“预分装+常规提取”检测方案是什么呢？

这就是采用非洲猪瘟病毒荧光PCR快速检测试剂盒（预分装+常规提取）的操作方案

也就是前面提到的试剂盒3：预分装+常规提取。和试剂盒1：预分装+免提取相比，差异就在于样本的核酸提取环节。这种方案差异就在核酸提取这环节，需要另外配备全自动核酸提取仪或者手动提取核酸。这主要体现在某些病毒浓度非常低的样本而言，如环境样本等，要求更精准可以采用这方法。对于血液样本和组织样本来说，这几种试剂盒没有明显的差异。

不同类型样本核酸提取环节操作如下所示：

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不分装+常规提取检测方案是什么？

这就是采用非洲猪瘟病毒荧光PCR快速检测试剂盒（不分装+常规提取）的操作方案。

从包装明细可以看出其细微差异。其他操作类似。

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不同环境下PCR扩增程序是否有差异？

这里分快速扩增程序和标准扩增程序。前者适用于便携式的快速扩增设备，后者适用于专业实验室的设备。详细扩增程序如下：

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中牧试剂盒的性能如何呢？

一方面可以通过浓度梯度测试，把样品进行梯度稀释后，看扩增曲线图是否“优美”。如下图就是比较理想的梯度测试结果。

二是测试试剂盒的特异性和灵敏度。

三是可以通过对相同样本，采用不同的试剂盒来对比，看检测结果如何。如下图，前者性能优于后者。

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中牧试剂盒最低检出量是多少呢？

这可以通过设计试验来验证。比如：用浓度为5×103copies/uL的ASFV的P72全长标准质粒作为待测样本，通过梯度稀释，测试非洲猪瘟病毒荧光PCR快速检测试剂盒（预分装+免提取）的灵敏度，看其最低检出量。

如下设计：

模板浓度分别5copies/ul、50copies/ul、500copies/ul、5000copies/ul，上样量为2.5uL。

按说明书操作，结果如下：

结论：ASFV P72稀释3个梯度后，结果曲线图如上所示，模板浓度为5copies/ul（上样量12.5copies）的ct值约为38，根据判定依据，结果为阳性。换句话说，待测样本的模板浓度≥5copies/ul，即可检出阳性，灵敏度相当高。

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快速检测试剂盒操作常见注意事项有哪些?

1．在操作中，应使用不含荧光物质的一次性手套（经常替换）、一次性移液器吸头（带滤嘴自卸式）；不能用手直接触摸PCR反应管底部。在试剂准备和标本处理时应使用生物安全柜（负压式）或防污染罩，以防止对环境的污染。

2． 离心机、PCR扩增仪等仪器设备应经常用75%乙醇擦拭消毒；每次实验前后用10%次氯酸或75%乙醇擦拭移液器、操作台。

3．实验中涉及的有害有毒的标本及试剂应该妥善放置，专人保管；废弃物应置专门容器中，妥善处理。

4．荧光探针试剂应避光保存，加入反应液体后，应尽快配置好反应体系进行扩增。

5．配制反应体系时，应注意移液器的使用方法。所有的液体应加样于近液面处；液体的混匀不能使用移液器吹打。

6．配制反应体系过程中若需标记，请在PCR反应管两端管盖两端多余部位标记，不要标记在PCR管上。

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还有其他注意事项吗？

对于已经预分装的试剂盒，操作要注意以下几点：

1、加样本前：

1）计算当次实验所需要的反应数，取等量的8联PCR反应管（内装有PCR反应液）。剩余试剂放回-20℃冰箱冷冻保存；

2）为避免试剂附着在管壁上，试剂在使用前于2000rpm离心10 s。

2、加样本时：

1）打开PCR反应管盖，建议用镊子逐个开启，避免液体飞溅。

2）沿壁加样，勿接触到反应液。

3、加样本后：

盖好PCR反应管盖， 2000 rpm 离心10 s以去除管壁附着液体。

结语

中牧股份始终坚持在抗击重大动物疫病、保持养殖业健康发展等方面发挥“国家队”和“主力军”作用。生物制品事业部必不忘品质初心，牢记央企使命，积极践行“以新担当应对大变局，以新作为推进大变革”的要求，为推动公司高质量发展注入了新的动能和活力。

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