印染干货! 荧光染料大总结!

荧光染料

荧光显微镜技术的基本原理是借助荧光剂让细胞成分呈现高度具体的可视化效果，比如在目的蛋白后面连一个通用的荧光蛋白—GFP。在组织样本中，目的基因无法进行克隆，则需要用免疫荧光染色等其他技术手段来观察目的蛋白。为此，就需要利用抗体，这些抗体连接各种不同的荧光染料，直接或间接地与相应的靶结构相结合。此外，借助荧光染料，荧光显微镜技术不只局限于蛋白质，它还可以对核酸、聚糖等其他结构进行染色，即便钙离子等非生物物质也可以检测出来。

01 免疫荧光(IF)

在荧光显微镜技术中，可以通过两种方式观察到你的目的蛋白：利用内源荧光信号，即通过克隆手段，用遗传学方法将荧光蛋白与目的蛋白相连；或利用荧光标记的抗体特异性结合目的蛋白。

有些生物学问题采用第二种方法会更有用或更有必要。比如，组织学样品无法使用荧光蛋白，因为通常来说，标本都是从无法保存荧光蛋白的生物体中获取。此外，当有一个有功能的抗体可用时，免疫荧光法会比荧光蛋白技术快很多，因为后者必须先克隆目的基因再将DNA转染到适当的细胞中。

荧光蛋白的另一项劣势在于其本身属于蛋白质。因此，细胞内的这些荧光蛋白具有特定的蛋白质特性，其会导致附着的目的蛋白质发生功能紊乱或出现误释的情况。然而，荧光蛋白技术仍然是观察活细胞的首选方法。

免疫荧光法利用了抗体可以和相应抗原特异性结合的这个特性，对此它还有两种不同的表现形式。最简单的方式是使用可与目的蛋白相结合的荧光标记抗体。这种方法被称为“直接免疫荧光法”。

在很多情况下，我们可以利用两种不同特性的抗体。第一种抗体可以结合目的蛋白，但其本身并未进行荧光标记（一抗）。第二种抗体本身就携带荧光染料（二抗），并且可以特异性结合一抗。这种方法被称为“间接免疫荧光法”。

这种方法存在诸多优势。一方面，它会产生放大效应，因为不只一个二抗可以与一抗相结合。另一方面，没有必要始终用荧光染料标记目的蛋白的每个抗体，但可以使用市售荧光标记的二抗。免疫荧光中广泛使用的荧光染料包括FITC、TRITC或一些AlexaFluor®染料，下文均有提及。

02 FITC和TRITC

异硫氰酸荧光素(FITC)是一种有机荧光染料，目前，这种荧光染料仍用于免疫荧光和流式细胞术中。在495/517nm处，该染料会产生激发/发射峰值，并可借助异硫氰酸盐反应基团与不同抗体结合，该基团可以和蛋白质上的氨基、巯基、咪唑、酪氨酰、羰基等基团相结合。

而它的基本成分——荧光素，其摩尔质量为332g/mol，常被用作荧光示踪剂。FITC(389g/mol)是用于荧光显微镜技术的首批染料，且其被当成AlexaFluor®488等后续荧光染料的发端。该染料的荧光活性取决于它的大共轭芳香电子系统，而该系统受蓝色光谱中的光所激发。

经常与FITC同时使用的另一种染料是与其相似的TRITC[四甲基罗丹明-5(6)-异硫氰酸]。与FITC相反，TRITC并非荧光素，而是罗丹明家族的衍生物。罗丹明也具有一个大的共轭芳香电子系统，正是该系统引发了它们的荧光行为。

还有一点与FITC相反，TRITC(479g/mol)由最大波长为550nm的绿色光谱中的光所激发，它的最大发射波长为573nm。与蛋白质（例如，抗体）结合也基于异硫氰酸盐反应基团。

虽然FITC和TRITC仍在使用，但由于它们属于发光相对较弱的荧光染料且它们的优势仅仅是经济实惠，因此，在最新的显微镜技术中并不推荐。

图1：果蝇胚胎发育，绿色：FITC；红色：TRITC

03 青色素

这类荧光染料相对较少，从青色素衍生而来，也是其名称的由来：Cy2、Cy3、Cy5和Cy7。上述所有青色素均可以通过其反应基团与核酸或蛋白相连。例如，采用了蛋白标记的马来酰亚胺基团。有趣的是，对于荧光，Cy5对其周边电子环境非常敏感，该特征可用于酶测定。

附着蛋白质的构象改变会导致荧光发射产生阳性或阴性变化。此外，Cy3和Cy5还可用于FRET试验。青色素染料是一种相对较老的荧光染料，但却是其他荧光染料在亮度、耐光性、量子产率等方面得以改善的基础。

04 AlexaFluor®染料

AlexaFluor®染料是带负电荷且亲水的荧光染料系列，该系列染料囊括范围较广，且经常用于荧光显微镜技术之中。

这些染料的名称是由其发明者RichardPaulHaugland以他儿子AlexHaugland的名字命名的。该产品标识是MolecularProbes（美国生命科学技术公司LifeTechnologies旗下子公司，注：2014年2月LifeTechnologies被ThermoFisher收购）的商标。此外，这些产品标识中也涵盖了相应的激光激发波长。

例如，应用范围很广且最大激发波长为493nm的AlexaFluor®488，可由标准的488nm激光激发。AlexaFluor®488的最大发射波长为519nm，正是因为具备上述特性，使得AlexaFluor®488与FITC的属性相似。

尽管AlexaFluor®488是一种荧光素衍生物，但与FITC相反，它拥有更佳的稳定性和荧光亮度，且pH敏感度也更低。所有AlexaFluor®染料（比如，AlexaFluor®546、AlexaFluor®633）都是不同基础荧光物质的磺化形式，例如，荧光素、香豆素、青色素或罗丹明，它们的摩尔质量在410至1400g/mol范围之内。

图2：小鼠转基因胚胎、肢间体节，E10.5小鼠转基因胚胎的5个肢间体节：EpaxialMyf5eGFP；GFP-Alexa488免疫组化染色；用Desmin-Cy3对胚胎肌肉纤维进行染色，用HoechstSize自上而下揭示细胞核：3.5mm(a)，800µm(b)。

图3：小鼠成纤维细胞，绿色：F-Actin，FITC；红色：Tubulin，Cy5；蓝色：细胞核，DAPI。图片来源：德国·海德尔堡·马克斯-普朗克研究所·GünterGiese博士

05 DNA染色

在荧光显微镜技术中，不只研究蛋白结构，核酸同样具有重要的研究意义。有时候，必须通过检测细胞核来确定细胞的精确位置及其数量。最常用的一种DNA染色剂当属DAPI(4',6-二脒基-2-苯基吲哚)，其可与DNA双螺旋的A-T富集区域相结合。如果DAPI附着到DNA上，其荧光强度将比游离状态要高。该染色剂受最大波长为358nm的紫外光激发，其发射光谱非常宽，在461nm处达到峰值。此外，还可对弱荧光进行RNA结合检测。在这种情况下，发射波长将转移至500nm。有趣的是，DAPI能够穿透整个细胞膜。因此，它可以用于固定和活细胞之中。

第二种被广泛使用的DNA染色剂就是Hoechst染料系列，这些染料原先都是由HoechstAG这家化学公司生产的。Hoechst33258、Hoechst33342以及Hoechst34580均为双苯酰亚胺，可嵌入A-T富集区域，因此，该系列染料很少用到。与DAPI相似，这三种染色剂都可受最大发射波长为455nm的紫外光激发，而未被结合的染色剂，其最大发射波长在510–540nm之间。Hoechst染色剂还具有细胞渗透性，因此可用于活细胞或已固定的细胞中。该染色剂与DAPI的不同之处在于，它们的毒性较低。

碘化丙啶（Propidium-Iodide，PI）是一种不能透过细胞膜的DNA染色剂。由于具备上述特性，该染色剂无法进入完整的细胞中，因此，该染色剂常用于区分细胞群中的活细胞和死细胞。此外，碘化丙啶还是一种嵌入剂，但对于不同的碱基并不存在结合的差异性。该染色剂与核酸结合后，最大激发波长为538nm，最大发射波长为617nm。未结合PI的最大激发和发射波长和光强会更低一些。PI还可结合RNA，同时无需改变自身的荧光特性。有时候为了区分DNA和RNA，有必要使用适当的核酸酶。

不需要前期处理，吖啶橙就可以鉴别DNA与RNA。吖啶橙与DNA结合后，最大激发/发射波长为502nm/525nm，而与RNA结合后，最大激发/发射波长为460nm/650nm。此外，它还能够进入溶酶体等酸性区室。在这里，阳离子染料被质子化。在这种酸性环境下，吖啶橙由蓝色光谱中的光激发，但发射波长在橙色区域达到最大。由于凋亡细胞具有大量被吞噬的酸性区室，因此，吖啶橙常用作此类细胞的标记物。

06 区室和细胞器特异性染料

在荧光显微镜技术中，往往要对溶酶体、核内体等细胞区室以及线粒体等细胞器进行染色。为此，该部分介绍了一系列可供选择使用的特异性染料。

观察线粒体最常用的方法就是利用MitoTracker®，它是一种可透过细胞的染料，包含轻度巯基化的氯甲基活性部分。正因如此，它可与半胱氨酸残基的游离硫醇基反应，从而与基质蛋白实现共价结合。MitoTracker®有不同的颜色和修饰类型（参见表1），此外，它还是MolecularProbes的商标。与罗丹明123(Rh123)或tetramethylrosamine等常规线粒体特异性染色剂不同，在用固定剂破坏膜电位后，MitoTracker®不会被洗掉。

依据线粒体染色剂，还有些染料可以标记溶酶体等酸性区室，这类染料被称为LysoTracker。它们由连接一个荧光基团的弱碱基团组成，具有膜穿透性。最有可能的情况是，这些碱基因质子化作用的影响而对酸性区室具有亲和性。LysoTracker具有多种不同的颜色可供选择（参见表1）。

与溶酶体相似的区室是酿酒酵母等真菌中的液泡，这种膜密闭空间也是一种酸性环境。如果要在荧光显微镜下观察上述区室，则要使用FM4-64®或FM5-95®等苯乙烯基染料。

对于蛋白质分泌实验，内质网(ER)具有重要的研究意义。对上述区室进行染色的一种典型染料为DiOC6(3)。该染料虽然偏好ER，但仍会结合线粒体等其他细胞器膜。对ER进行特异性染色的另一种方法是，使用ER-TrackerGreen和Red等ER-Tracker，而ER-TrackerGreen和Red是基于BODIPY的两种染料，其与格列本脲（一种磺酰基脲酶）连接，并可与仅存于内质网膜上的ATP敏感性钾通道结合。BODIPY（硼-二吡咯亚甲基，boron-dipyrromethene）是一种几乎不溶于水的、对pH相对不敏感的染料基团，该染料对蛋白质标记没太大用处，但却是脂质和膜标记的良好工具。

对于与ER相邻的高尔基体，可以用NBDC6-ceramide和BODIPYFLC5-ceramide等荧光神经酰胺类似物对其进行标记。上述神经酰胺为鞘脂类，其在高尔基体中高度富集。

借助基于脂质的染料，可以对脂筏等特异膜区域进行染色。使用NBD-6Cholestrol或NBP-12Cholesterol可以观察胆固醇富集区域（AvantiPolarLipids）。

除了使用特异性非蛋白荧光染料对细胞区室进行标记之外，还可以借助对细胞中不同位置有偏好的蛋白质对目标区域进行染色。这些蛋白质可以和荧光染料相连，并可通过荧光显微镜进行观察。运用这种方法的一个实例是：麦胚凝集素(WGA)可以与细胞质膜中的唾液酸和N-乙酰葡萄糖胺基特异性结合，将WGA与荧光染料偶联，这样我们就可以观察到细胞质膜了。

图4：Pukinje细胞，小鼠小脑皮质三重标记的纵侧截面图。红色：anti-calbindin-D28k/Cy3；绿色：anti-GFAP/Cy5；蓝色：Hoechst33258

图5：牛肺部内皮细胞。红色：用MitoTracker®RedCMXRos标记的线粒体；绿色：用绿色荧光BODIPY®FLphallacidin标记的纤维状肌动蛋白；蓝色：用DAPI标记的细胞核。使用三维盲反褶积可以改善该图像的质量。

07 离子成像

在有关神经元方面的研究中，观察基因活性或细胞运动等对于了解细胞的离子浓度具有重要意义。钠、钙、氯或镁离子对很多不同的细胞活动都具有较大影响。一般情况下，借助荧光标记的螯合剂可将离子困住，螯合剂在结合相应离子后会改变离子的光谱特性。例如，利用该原理的钙指示剂fura-2、indo-1、fluo-3、fluo-4和Calcium-Green等。对于钠离子的检测，通常使用SBFI(sodium-bindingbenzofurzanisophthalate)或SodiumGreen。PBFI(potassium-bindingbenzofurzanisophthalate)可以检测钾离子。

有趣的是，还存在以蛋白质为主的钙指示剂，其中一种是基于水母化学发光蛋白—水母素。水母素、发光体腔肠素、分子氧和Ca2+的相互作用会释放蓝光，这是在荧光蛋白质的发现过程中非常著名的机制。

08 生产实践

原来高品质的荧光单子也是那么容易搞定的

我们先来看下这组荧光料

分散荧光染料在纺织领域的应用局限于涤纶錦纶等合成纤维及其混纺织物的染色。分散荧光染料的品类也相对越来越丰富，一般有荧光黄系列，例如：荧光黄10GN,荧光黄8GFF。荧光红系列，例如：荧光桃红BG，荧光桃红FBS，分散荧光红G等等。。下面以荧光红G（DISPERSEREDG.CAS:70294-19-8）为例跟大家探讨染色过程中所需要注意的几个问题。

1，PH值对分散荧光红G上染情况的影响。

在pH值偏碱时，布样的ks值很低，G红上色很浅且发兰不够鲜艳。ph值偏酸时，布样的ks值也不是最大，色光偏兰，同样不够鲜艳。pH值在5.5-6.5左右时，上色最好。所以分散荧光红G上色的pH与一般分散染料有所不同，它对PH的要求更高，染液偏碱或偏酸都会影响其上色效果。

2，水质对G红上色的影响。

众所周知，织布染色的匀染性和通透性与水质息息相关，螯合分散剂的应用中越来越重要。通过实践，螯合分散剂的加入对布样ks值的影响不是很大。说明对颜色的深浅没有太大的影响。通过布样色光的对比，螯合分散剂的添加使得布样的颜色更加鲜艳，不加螯合分散剂的布样明显发兰，发旧，不能充分发挥分散荧光红G的荧光效果。

3，染色温度的影响

升温曲线到100度时，布样的ks明显增加，得色率随着温度的升高而增大，在135度时ks值最高，数值上130度和135度时，布样的ks值接近，在生产过程中，考虑到成本和其它因素影响，选择13O度上染。这个跟常规分散染料的数据基本吻合。

4，保温时间的影响

布样的KS值随着保温的时间增加而变大，保温60分时，KS值最大。保温90分时，ks值变小。这是因为染料上染织物是吸附和解吸的过程。保温时间过长，解吸到染夜中的染料越多，ks值越小。说明分散荧光红G保温60分钟时，得色率最高，染色最饱和。

综上所述，由此可得：

①pH在5.5~6.5时，G红的发色最好，最漂亮，染色最纯，过碱或过酸G红都不能很好地发色，都会偏蓝、偏暗或偏浅；

②G红在100℃时明显上色，130℃保温60min时，布样的K/S值最大；

③G红的提升性能不是很好，用量在2.5%~3.0%时，提升性能下降；

④水质的变化对G红的染色效果也有很大的影响。在生产过程中，小样和大货的工艺要保持一致，不然就会影响颜色的一次成功率，特别是和其他染料拼色时，还要综合考虑，提高一次成功率。

⑤荧光红G色泽非常鲜艳，如果不能一次成功，出现加色继续保温的情况，往往效果不理想，一般会发暗，达不到预期的效果。再加上保温温度被延长，到最后会越加越浅。所以染色尽量要做到一次成功。

⑥如果因为客观原因颜色不准，需要剥色再重新染色，那效果一定是不尽如人意的。出来的色光一定会很灰很暗。如果再要通过EN471测试，那基本上是不可能的。所以做荧光红的单子一次成功是效果最佳。

⑦染色后用特俪洁做还原清洗后不会发暗和出缸前加适量的柠檬酸会有防止布面吐兰的情况。

⑧因为荧光红G的升华牢度不是很好，特别在染色深度超过3%的时候定型温度不宜过高，一般定型温度条件140~150度为最佳。

⑨原则上说荧光红G是属于中温型染料，所以在拼色的过程中尽量和中温型染料配伍。

荧光染料的性能其实跟常规分散也是差不多的，只是它的色泽非常鲜艳，所以多注意细节，染高品质的荧光红的单子也是没有问题的。

09 荧光染料及其激发和发射波长峰

上文提到的所有染料在下表中均有统计。此外，还涵盖了其他荧光染料及其激发和发射波长峰值。