细胞裂解液不同配比及应用

细胞裂解液不同配比及应用

方法一：

1. 细胞裂解准备

1) 细胞培养在合适环境中，经过处理后，在细胞密度达80-90%时收集细胞；

PS：实验操作时所用的试剂和仪器为DNA free和RNA free。

2) 细胞计数。通常一次IP实验所需的蛋白量在2-5mg，也就是5-20×106细胞左右；

3) 离心，去除上清（4℃，1000×g，5min）；

4) 再用相同离心条件，用预冷的PBS洗涤2次，去除上清；

5) 用与底部沉淀相同体积的polysome lysis buffer重悬沉淀，上下吹打，把成团的细胞打散；

6) 冰上孵育5min；

7) 将产物放置在-80，促进裂解（可在-80放置数月）

方法二：

一、试剂准备

1、新鲜配制冷的RIP A裂解缓冲液:

150 mM NaCL，

1% NP-40 (去垢剂)，

0.1% SDS (去垢剂)，

2ug/ml Aprotinin (蛋白酶抑制剂) (使用前加入)，

2ug/ml Leupeptin (蛋白酶抑制剂) (使用前加入)，

1mM PMSF (蛋白酶抑制剂)，

1.5 mM EDTA (蛋白酶抑制剂)，

1mM NaVanadate (磷酸脂酶抑制剂)(任选)

以上所有试剂均按比例溶于150 mM NaCL溶液中。

2、冷的PBS 中加入 1 mM PMSF

1.5 mM EDTA，

1mM NaVanadate (钒酸钠)(任选)

3、对数期生长状态佳的细胞，75cm2至少3-4瓶(90%以上生长面积)。

二、实验步骤

1、将长满细胞的培养瓶放置在冰上，用吸液管吸出培养液。加入足够的冷的PBS在培养瓶中充分洗涤细胞表面，以洗去瓶中残留的培养基，倒掉PBS，重复以上操作2-3遍。在最后一次洗涤中尽可能吸干残留的PBS，尽量在冰上操作。

2、向培养瓶中加入冷的RIPA裂解缓冲液 (每75cm2培养瓶加1ml). 然后用细胞刮子沿着瓶壁开始刮细胞，如果所需要刮的同种细胞有多瓶，则将第一瓶刮下的细胞液吸出转入下一瓶中继续刮 (由于处理后的细胞裂解液较粘稠，所以宜用直径大点的吸液管吸取)。

3、吸出刮好的细胞裂解液置于14ml 离心管中 (置于冰上)，然后重复步骤2以刮取剩下的细胞。

4、尽可能将多的细胞裂解液收集到14ml的离心管中，样品插入冰盒进行超声，超声强度以不产生泡沫为准，超声每次2-3秒，重复3-4次。如仍有细胞碎片或沉淀，应离心10000rpm,10分钟，留取上清。

5、取出小量细胞裂解液测其蛋白浓度(用Biorad Bradford 试剂盒或紫外分光光度计，在A280测定)，分装保存在-70℃。

方法三：

NP-40 or Triton-100，

1%TrisHCl (pH 8.0)

50mmol/LNaCl

150mmol/LPMSF(苯甲基磺酰氟)，

0.1mmol/L(100μg/ml)Pepstatin(胃蛋白酶抑制剂)，

1μmol/L(0.7μg/ml)Leupeptin(亮抑制肽)， 

0.5mg/mlAprotinin(抑蛋白酶肽)，

0.3μmol/L(1μg/ml)

(注:PMSF贮存液:100mmol/L即17.4mg/ml于异丙醇中;

Aprotinin 贮存液:10mg/ml溶0.01mol/LHEPES(pH8.0);

Leupeptin 贮存液:10mg/ml溶于水中;

Pepstatin 贮存液 10mg/ml于甲醇液中.均于-20℃保存)

裂解操作步骤：离心收集1×107个细胞加入4℃预冷1%NP-40裂解液100μl剧烈震荡使细胞充分悬浮混匀(如为组织进行匀浆)，4℃放置15~30min。4℃离心，15000rpm,10min，取上清备用。

方法四：

细胞裂解液的主要目的:

1. 利用去污剂破坏脂质双分子层，破裂细胞;

2. 溶解蛋白;

3. 蛋白变性使其稳定;

4. 抑制蛋白酶活性推荐RIPA buffer: 

50 mM Tris-HCl pH 7.4 缓冲体系

150 mM NaCl 等渗体系，

1 mM PMSF强大的蛋白酶抑制剂

1 mM EDTA 变性剂和稳定剂

5 μg/ml Aprotinin (抑肽酶)蛋白酶抑制剂

5 μg/ml Leupeptin 蛋白酶抑制剂

1% Triton x-100 破坏细胞

1% Sodium deoxycholate 中度变性剂和蛋白溶解剂

0.1% SDS 强变性剂和蛋白溶解剂

其中PMSF等蛋白酶抑制剂最好另外配制，-20℃保存，用前混合。蛋白酶抑制剂较贵，如果你的经费有限，可以仅用PMSF试一试，能出结果就可以。

用于普通的 Western、IP或co-IP，我们推荐使用Western及IP细胞裂解液(P0013)，该裂解液已被国内各大研究机构广泛使用，用户普遍反映很好。裂解细胞或组织后，没有非常粘滞的透明状DNA团块形成，不必采用超声处理等就可以非常理想地用于后续操作。另外该裂解液裂解的产物也适合用于磷酸化蛋白的Western检测。对于某些特殊蛋白的IP，如果发现Western及IP细胞裂解液(P0013)效果不是非常理想，可以尝试用RIPA裂解液(强、中或弱)或NP-40裂解液。如果发现IP的时候背景很高，即非特异的蛋白也被IP下来，则需要选用裂解强度较高的裂解液，例如RIPA裂解液(强或中)。如果发现目的蛋白无法被IP下来，则说明裂解液的强度过强，可以使用较为温和的裂解液例如RIPA裂解液(弱)或NP-40裂解液。对于某些难溶解蛋白的Western，如果发现Western及IP细胞裂解液效果不是非常理想，可以尝试使用裂解强度更高的裂解液,例如RIPA裂解液(强、中)或SDS裂解液。RIPA裂解体系: 150 mmoL/L Nacl， 1.0% NP-40或Triton-x-100 ，0.5%脱氧胆酸钠， 0.1% SDS， 50 mmoL/L Tris ( ph8.0)。

不同裂解液成分及作用：