蛋白质分子中的信号肽（学习！）

   蛋白质分子中的信号肽研究开始于20世纪60年代，这方面的工作是在研究分泌蛋白的基础上进行的，当时的研究旨在了解，在核糖体上合成的新生肽链是通过何种途径被分泌到细胞外的。布洛贝尔及其合作者最先于1975年提出了“信号假说”：最初合成的一些氨基酸残基具有信号功能，决定了相应的蛋白质是否被分泌。

   肽链N末端的信号肽

   及其运作机制

   科学家经过系统的研究后，发现在一些分泌蛋白的新生肽链N末端，有一段长度不等的肽段，通常由20～30个氨基酸残基组成。它们的存在，决定了含有这类肽段的新生肽链能被分泌到细胞外，而在已被分泌到细胞外的成熟蛋白质中，则不再含有这类肽段。含有这类肽段的肽链通常被称为蛋白质的前体，而这类肽段则被称为前肽（prepeptide）, 或称为前序列（presequence）。因为这类肽段是新生肽链分泌到细胞外的信号，后来发现它们也是一些蛋白质定位在质膜和其他一些与细胞外相通的细胞器（包括内质网、高尔基体和溶酶体等）内的信号，因而也被称为信号肽。

   这些信号肽并不存在于成熟蛋白质中，因此只能从细胞内分离不成熟的肽链，然后测定它们的N末端氨基酸残基序列，才能了解信号肽的结构特征。经比较研究，发现分泌蛋白N末端信号肽的序列并没有很高的同源性，但是仍有一些可循的规律。其中疏水氨基酸比较多，而且信号肽又可分为几个部分，它们分别具有不同的结构特征，而且在行使信号功能时所起的作用各不相同。

   新生肽链中的信号肽只有和相应的识别系统相互作用后，才能发挥作用。信号肽运作的机制相当复杂，有关组分包括信号肽识别颗粒（SRP）及其受体、信号序列受体（SSR）、核糖体受体和信号肽酶复合物等。这些组分中大多数是由多个蛋白质分子组成的复合物，有的还含有核酸。例如，SRP就由1条RNA（约300个核苷酸）和6条肽链组成。信号肽发挥作用时，首先是尚在延伸的、仍与核糖体结合的新生肽链中的信号肽和SRP结合，然后通过三重结合，确保新生肽链正确无误地附着并进入内质网腔，随后被分泌到细胞外。

   这三重结合是：信号肽和SSR的结合、SRP和其受体的结合，以及核糖体和其受体的结合。当信号肽将新生肽链引导进入内质网腔内后，在信号肽酶复合物的作用下，已完成使命的信号肽被切除，被切除信号肽的肽链在内质网腔和高尔基体内，进一步受到各种类型的转译后的加工，包括肽链的折叠、一些残基的修饰（例如糖基化等）、前体的激活等，最终成为有特定结构和功能的蛋白质，并被定位到机体中的特定部位行使其功能。

   信号肽与蛋白质全方位

   定位、修饰和降解

   布洛贝尔等早年提出的信号肽是与分泌蛋白相关的，然而许多细胞内蛋白质的新生肽链在合成后，和分泌蛋白一样，也进入内质网内，但是并没有被分泌到细胞外，而是定位在细胞质膜上，或是定位在内质网、高尔基体的腔内或其细胞器的膜上；还有许多蛋白质的新生肽链在合成后，被转运到细胞核、线粒体和其他细胞器内。在“信号假说”的启示和有关蛋白质氦基酸序列的比较研究基础上，一系列和N末端信号肽不同的新的信号肽也先后被发现。这些信号肽负责不同类型蛋白质的新生肽链的定位。信号肽的功能，已经突破了研究初期的局限，它不仅决定一个蛋白质是否为分泌蛋白，而且和蛋白质或其新生肽链在细胞内的全方位的定位有关。

   新生肽链或蛋白质中，一些残基的化学修饰也是转译后加工的一个重要内容。发生修饰的残基决不是任意的，也和肽链中的氨基酸序列密切相关。从这个意义而言，这些和残基修饰有关的肽段，也可认为是残基修饰的信号肽。例如，在肽链中连接有N－糖链的天冬酰胺残基（N），一定是位于Nx（S／T）这种特定三肽序列中的天冬酰胺。又如，一些蛋白质的C末端附近可以为萜类所修饰，能接上萜类的半胱氨酸酸残基，同样是具有特定序列的C末端四肽中的半胱氨酸酸残基，而且其中某些残基还决定了所接上的萜类的长度。为此，可认为在肽链中尚存在着与残基修饰相关的信号肽。

   还有一些肽段的存在与含该肽段肽链的降解有关，这类肽段可以视为肽链降解的信号肽。例如，细胞质中某些常有KFERQ/RIDKQ序列的蛋白质易于进入溶酶体，然后在那里被降解。又如，细胞质内快速被降解的蛋白质通常含有PEST四肽序列。

   以上几个例子说明，信号肽的概念已经由原来的决定蛋白质是否被分泌的信号，拓展为决定蛋白质在细胞内的全方位的定位，甚至可拓展为决定残基修饰和肽链降解的信号。

   决定蛋白质定位的非肽类信号

   在深入研究蛋白质细胞内定位的过程中，科学家还发现，定位于溶酶体中的蛋白质的氨基酸序列中，并没有高度同源的序列，但却都含有特定的糖链结构，即甘露糖－6－磷酸。定位于溶酶体中的蛋白质，在新生肽链合成后，和分泌蛋白一样，先在N末端的信号肽帮助下，进入内质网，然后被糖基化。但与其他蛋白质的糖基化不同的是，这类蛋白质的糖链中，特定甘露糖基的6位接上磷酸－N－乙酰氨基葡萄糖，经酶作用切除N－乙酰氨基葡萄糖，产生了甘露糖－6－磷酸。后者再和专一的受体结合，将蛋白质引导进入溶酶体中。甘露糖－6－磷酸及其受体，是目前研究得比较清楚的非肽类的蛋白质定位信号。

   迄今为止，对何种信号决定了蛋白质在合成后滞留在细胞质中，还知之甚少。相当多的细胞质中的蛋白质，其N末端是被酰化的。酰化是否就是蛋白质留在细胞质中的信号，还有待进一步的研究。如果确是如此，则酰化将是又一种非肽类的蛋白质定位信号。

   结 语 和展望

   以往，人们着重于蛋白质的结构和功能的研究，提出了蛋白质的结构层次，导致了结构生物学的诞生。布洛贝尔等的开创性工作，为蛋白质的研究开辟了崭新的领域：蛋白质的空间属性。蛋白质的结构和功能研究固然重要，然而，离开了蛋白质的空间定位讨论蛋白质的功能，在一定程度上，是没有意义的。

   从理论上看，目前虽然已经发现了许多不同类型的信号肽和蛋白质定位信号，但是对有些蛋白质（如高尔基体膜上蛋白质），定位的信号仍不了解。除了N末端与新生肽链进入内质网有关的信号肽，以及进入溶酶体的信号甘露糖－6－磷酸的运作机制研究得较多外，其他的信号肽是如何起作用的，还知之甚少。例如，关于决定蛋白质滞留在内质网腔内的信号肽KDEL，对其受体的研究还刚开始。这方面的研究尚有待深入。

   蛋白质的定位和相关的信号肽研究不仅有重要的理论意义，而且也有其潜在的应用价值。

   在有机体内，所有的生物分子都是协同作用的，均是在特定的部位、特定的时间，行使其特定的功能。如果溶酶体中诸多的水解酶没被特定的信号局限在溶酶体内，而散流在细胞和机体的任意部位，对细胞和机体将是危害无穷的。同样地，在细胞内合成的蛋白质如果不能正确定位，而是在不适当的部位大量堆积，必然会导致疾病的发生。目前已经发现，一些疾病与蛋白质的不正确定位有关。

   在当前，利用基因工程技术生产药用蛋白质备受人们的关注，但是所用的技术路线不同，所取得的效果也有天壤之别。同样是在大肠杆菌中表达一种蛋白质，如果能给以合适的信号肽，就有可能得到分泌性的蛋白质产物，利于产物的分离纯化。

   近年来，由于基因工程技术的不断完善，人们已经可以通过基因工程的方法，改造蛋白质的序列，制备各种融合蛋白。这些方法不仅是研究和发现与蛋白质定位相关的信号肽的有效手段，而且藉此人们还可有目的地改变蛋白质的定位。最近有些实验室在一些蛋白质的C末端，接上一些能导致蛋白质糖基磷脂酰肌醇化的肽段，从而将一些原本不存在于细胞质膜上的蛋白质定位了到质膜上，并称之为细胞表面工程。

   随着对蛋白质空间属性认识的不断深入，肯定会出现更多与之相关的应用前景。

   [1] Loh Y P. Mechanism of Intracellular Traf

   ficking and Processing of Pro－protein.

   BoaRaton：CRC Press，l993

   [2] 王克夷. 生命的化学，1995，15（2）：

   1；15（3）：1；15（4）：1

   [3] Cold Spring Harbor Symposium on

   Quantitative Biology，60，Protein Kine

   sis：The Dynamics of Protein Trafficking

   and Stability. New York：Cold Spring Harbor Laboratory Press，1995

   [4] Hurtly S M. Protein Targeting. Oxford：IRL

   Press，1996

   [5] Hong W J. Protein Trafficking Alone the

   Exocytotic Pathway. New York：Springer，

   1997

另外还有一篇不错的文章，也同时展示出来与大家共享

 关于信号肽序列的分析可以上NCBI里的BLAST里搜索比对,也可以用软件分析,网上也有在线分析的，请参阅张成岗主编的生物信息学一书

 1。信号肽主要有书水性氨基酸组成，这对于原核表达是致命的，所以，宁可错杀一千，不可漏过一个。况且少2个氨基酸，对随后的活性，抗原性一般不会有影响。 2。现在的信号肽预测已经发展得很好了，如果评分>0.95，根据我的经验，一般可以肯定是准确地。而且原始文献也不一定准确，要看通过啥方法确定的信号肽，即使是aa测序，有时也不能够确定具体的位点。

目的基因一般是已知基因，可以从Genbank查找该基因的资料，一般都标出信号肽的序列。 http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/是非常不错的信号肽预测软件，我们用几个已知信号肽的基因作过验证，也根据它的预测结果设计过实验。

 真核载体pcDNA3.1是非融合表达载体，需要自己添加信号肽。如果你做胞内表达，当然就不必考虑信号肽问题了，但有注意你的目的基因胞内表达将失去糖基化等翻译后加工机制，可能会影响活性，胞内蛋白的纯化通常也要比分泌蛋白要复杂一些。 

以下网站对目的蛋白的信号肽进行分析：    www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/    www.stepc.gr/~synaptic/sigfind.html    bioinformatics.leeds.ac.uk/prot_analysis/Signal.html

 如果我要使目的基因在细胞外表达，而经过分析我的目的片段并没有信号肽，我该如何设计此段多肽？     信号肽的设计大体有三种，一是用基因自身的信号肽，二是用其他基因来源的信号肽，三是用人工设计的信号肽。用基因自身的信号肽优点是切割位点有把握，可以得到天然的N末端，这对于体内用途较重要，但基因本身的信号肽分泌能力未必是最佳的。使用其他基因来源的信号肽一般选择分泌能力强的序列，如免疫球蛋白的信号肽使用非常广泛，还有用MHC和某些细胞因子（如IL-2)的信号肽的，但这种设计往往会造成切割位点漂移，造成分泌后的蛋白N端缺失或增加几个氨基酸或N端不整齐，对于研究目的只要不影响活性就问题不大，但作为药物设计则容易招致疑问，毕竟表达产物不是天然的东西。人工设计的信号肽含有一段疏水氨基酸串作为核心，在切割位点前通常有碱性氨基酸。人工设计的信号肽一般分泌效率没问题但缺陷也是切割位点的准确性。     可以选择多个信号肽候选分子，然后用软件预测，选择预测结果最肯定，切割位点最特异的作为实际采用的设计。

 最近一段时间，看了一些关于Signal Peptide文章和网站。现在，我将比较有用的文章和网址归纳了一些，贴到此处： 1、预测有无信号肽： www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/ www.stepc.gr/~synaptic/sigfind.html bioinformatics.leeds.ac.uk/prot_analysis/Signal.html   （以上三个网址由Yong主任和Liven提供） http://psort.nibb.ac.jp/ http://www.cbs.dtu.dk/services/TargetP/ http://www.mbb.ki.se/tmap/index.html 2、一些有关信号肽的链接： http://plantst.sdsc.edu/plantst/html/links.shtml#analysis http://www.itb.unistuttgart.de/training/bioinformatics99/Solutions/4/Sessions/Sessio4.html http://bioresearch.ac.uk/browse/mesh/detail/C0887827L1772874.html http://bioinfo.hku.hk/emboss/sigcleave.html http://helios.bto.ed.ac.uk/bto/glossary/s.htm#signal hypothesis 3、在线课程： http://divcom.otago.ac.nz/infosci/courses/info331/2002/Lectures/24/index.htm 4、含信号肽的载体： http://www.med.umich.edu/vcore/Plasmids/pUMVC6a.htm http://www.med.umich.edu/vcore/Plasmids/pUMVC7.htm 可以检测序列中又无信号肽的软件: 下载地址: http://www.bio-soft.net/ 蛋白质分析-----AnthePro 5.0 介绍: 1.9兆，蛋白序列分析软件包ANTHEPROT 5.0，包括了蛋白质研究领域所包括的大多数内容，功能非常强大。应用此软件包，使用个人电脑，便能进行各种蛋白序列分析与特性预测,包括：进行蛋白序列二级结构预测；在蛋白序列中查找符合PROSITES数据库的特征序列；绘制出蛋白序列的所有理化特性曲线；在Internet或本地蛋白序列数据库中查找类似序列；计算蛋白序列分子量，比重与各蛋白残基百分组成；计算蛋白序列滴定曲线与等电点；选定一个片段后，绘制Helical Wheel图；进行点阵图（Dot Plot）分析；计算信号肽潜在的断裂位点等功能。