胶原蛋白的开发与应用研究进展

胶原蛋白是哺乳动物组织中含量最丰富的蛋白质，占机体总蛋白含量的30%。同时也是细胞外基质的重要组成成分，维持皮肤、软骨、肌腱、韧带和内脏等组织器官的结构和功能。其具有生物可降解性、低免疫原性及促细胞增殖分化的特性，是一类理想的生物医用和美容护肤材料[1]。传统的胶原蛋白主要通过热水浸提法、酸碱水解法和酶解法等从陆生动物结缔组织和水产加工副产物中提取。但是动物源胶原蛋白的分离纯化工艺复杂且单体分离较难，还可能携带病毒，存在安全隐患，在一定程度上限制了动物源胶原蛋白的应用和开发[2]。而利用基因工程技术生产胶原蛋白具有提取法不具备的优点，如产品纯度、稳定性及安全性高，是目前的研究热点。本文综述了近年来胶原蛋白在国内外研究中的进展，包括胶原蛋白的结构、分类、生产方法及应用等，重点阐述了胶原蛋白在食品、医药、生物材料及美容护肤领域的应用。

胶原蛋白是由多个原胶原组装形成的纤维状蛋白质。原胶原是胶原蛋白的基本单位，由3条多肽链组成。原胶原肽链的一级结构具有(Gly-X-Y)n重复单位，其中X和Y常为脯氨酸和羟脯氨酸，少数为赖氨酸和羟赖氨酸。3条原胶原肽链可通过链间氢键彼此盘绕形成稳定的三螺旋结构[3] (图 1)。在三螺旋构象稳定过程中羟脯氨酸羟基能形成强氢键，可提高胶原蛋白强度；脯氨酸和羟脯氨酸能使胶原三螺旋结构发生急剧扭曲，提高胶原蛋白的稳定性。

目前，已从40余种脊椎动物中鉴定出胶原蛋白基因，编码约29种类型的胶原蛋白(表 1)。基于一级结构、三螺旋结构域的长度、分子量、三重螺旋结构中断和末端结构域的大小和形状，胶原蛋白可分为4大类：第1类纤维型胶原，有Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅴ、Ⅺ、ⅩⅩⅣ和ⅩⅩⅦ型，其中Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ型在脊椎动物体内分布较多，Ⅴ和Ⅵ型分布较少，但对Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ型组装起辅助作用；ⅩⅩⅣ和ⅩⅩⅦ型在三螺旋结构域延伸较短时中断。Ⅲ、Ⅴ和Ⅺ型胶原经加工后保留C端肽和部分N端肽结构域；第2类三螺旋纤维型胶原(FACIT)，有Ⅸ、Ⅻ、ⅩⅣ、ⅩⅥ、ⅩⅨ和ⅩⅫ型。FACIT胶原并不形成胶原，但可与原纤维胶原相互作用，调节胶原纤维的形成和大小，并控制细胞外基质中的胶原合成；第3类网状型胶原，有Ⅳ、Ⅶ和ⅩⅩⅧ型。其中Ⅳ型胶原蛋白形成纤维状网状结构，而Ⅶ型胶原组装成锚定纤维，将表皮连接到真皮；第4类间断螺旋型胶原(MACITs)，有ⅩⅢ、ⅩⅩⅢ和ⅩⅩⅤ型。其中ⅩⅢ、ⅩⅩⅢ和ⅩⅩⅤ型胶原是Ⅱ型跨膜蛋白，由1个疏水的跨膜结构域、1个短的N端胞质域和3种胶原蛋白组成的胞外域组成。

胶原蛋白的生物合成可分为细胞内和细胞外2个阶段，如图 2所示。

在组织细胞的细胞核(nucleus)中，胶原分子的各个肽链的遗传信息由信使RNA (mRNA)将编码蛋白所需的信息转录到核糖体(ribosome)，在核糖体上合成1 000多个氨基酸残基的肽链，肽链转入内质网(endoplasmic reticulum, ER)中进行羟基化和糖基化修饰。(1) 羟基化修饰：在内质网中，肽链由脯氨酸、赖氨酸残基经脯氨酸羟化酶(prolyl hydroxylase)和赖氨酸羟化酶(lysyl hydroxylase)催化生成，羟化作用对三股螺旋的坚固性有重要作用，羟化不足的肽链在体温下不能形成坚固的三股螺旋，因而不能分泌至细胞外。(2) 糖基化修饰：在内质网中，肽链由半乳糖基转移酶及葡萄糖基转移酶催化将糖基连于5-羟赖氨酸残基上形成，该修饰有利于纤维的定向排列。经羟基化和糖基化修饰后的溶胶原蛋白，可形成三股螺旋前胶原而分泌至细胞外。

三股螺旋前胶原分泌到细胞外的溶胶原经内切酶作用后，水解N-末端和C-末端的附加肽链，形成原胶原蛋白，原胶原分子可在中性pH条件下，借分子间各部分不同电荷的相互吸引而自动聚合成胶原纤维，该聚合不稳定，需由赖氨酸氧化酶(lysyl oxidase)催化，将赖氨酸转变为醛赖氨酸(allysine) ε-醛赖氨酸后，首先与α-肽链上ε赖氨酸醛缩合生成ε-醛赖氨酸醛酸(allysine aldol)，然后与组氨酸反应生成醇醛组氨酸(aldol histidine)，后者再与5-羟赖氨酸进行醛胺缩合形成席夫碱结构可使4条α-肽链间共价交联，使得胶原微纤维的张力加强，韧性增大，溶解度降低，最终形成不溶性的胶原纤维[5]。

天然胶原蛋白原料主要来源于陆生动物和水生生物加工后的副产物。陆生动物源胶原蛋白主要指从猪、牛的皮和骨中提取的胶原蛋白。然而，由于疯牛病、口蹄疫等牲畜疾病的存在，导致此类胶原存在人兽共患病的风险。近年来的研究发现鱼皮、鱼骨和鱼鳞中也富含胶原蛋白。从水生动物组织中提取胶原蛋白不仅能够充分利用我国的水产资源，而且可以减少水产加工副产物对环境的污染[5]。因此，水生生物源胶原蛋白越来越受到人们的关注。此外，随着基因工程、蛋白质工程等分子生物学研究的快速发展和成熟，重组胶原蛋白研究也快速推进。与传统的提取法相比，重组胶原蛋白产品纯度、稳定性及安全性更高。然而，不同来源的胶原蛋白，其制备工艺和结构性质存在差异。

胶原传统的提取方法有热水浸提法、酸碱水解法和酶解法。热水浸提法以纯水作为溶剂，通常在高温(> 150 ℃)和高压(25 000 kPa)下进行。与化学水解法和酶水解法相比，热水浸提法环保，且操作工艺简单、经济、无毒且安全，是一种经济高效且可持续的提取技术。酸水解法通常以酸为介质(多为醋酸、盐酸、乳酸或柠檬酸)，从动物组织(猪皮、牛皮、驴皮、鱼等)中提取胶原蛋白。而碱水解法常以Ca(OH)2和NaOH为溶剂，其蛋白提取得率低于酸水解法。然而，酸碱水解法都容易导致胶原活性丧失，污染环境。酶解法则是利用胃蛋白酶、胰蛋白酶和木瓜蛋白酶等将胶原分子端肽间的共价键切除，促进胶原蛋白的溶出。其反应条件相对温和，不产生有毒物质，对胶原蛋白活性的破坏较小，被广泛应用于食品和制药行业。

提取法获得的胶原蛋白在某些生物材料应用中改性较差，易致病和产生免疫排异反应。近年来，合成化学的发展为这些问题提供解决方案。Gómez-Guillén等[6]利用三螺旋倾向自组装技术模拟天然胶原蛋白结构和热行为产生原纤维，通过调节氨基酸组成、温度和溶剂来控制胶原蛋白的稳定性和自组装长度。Falk等[7]将Fe2+添加到三螺旋胶原相关肽(collagen-related peptide, CRP)的溶液中触发自组装成形态多样的原纤维。化学合成法产生的三螺旋胶原蛋白，虽然解决了免疫排异和病毒隐患的问题，但是合成的技术比较复杂，成本较高，且无生物活性。因此，仅限于实验室研究。

基因工程技术生产胶原蛋白又称为重组胶原蛋白，是指基于人胶原蛋白的特征和主要功能域重新优化设计基因序列，然后通过选用各种宿主细胞，如转基因鼠、昆虫、转基因蚕、转基因烟草、大肠杆菌、酵母等生产重组人源胶原蛋白(表 2)。该技术生产的胶原蛋白具有安全性高、批次稳定、组分单一、活性高、无免疫排异等优点。不仅规避了传统提取方法存在的风险，还提高了胶原蛋白的亲水性能(表 3)。常用的宿主细胞包括大肠杆菌、酵母和转基因动植物，不同宿主表达系统有不同的特点。其中，动植物细胞的发酵培养难度大、纯化成本高，且产量低，不适宜于大规模生产，仅限于实验室研究。微生物培养及发酵成本较低，遗传背景清晰，操作性强，适宜工业化生产。

西北大学范代娣课题组成功利用大肠杆菌基因工程菌BL21(DE)发酵生产并分离纯化了类人胶原蛋白，改进了动物体胶原蛋白的水溶性、免疫排异性、吸收性等特性，并通过和西安巨子生物合作进行规模化生产[36]。同时该课题组从人胎盘组织中提取mRNA，反转录为cDNA，并以其为模板克隆出Ⅰ型胶原α1链基因后，与表达载体pPIC9K连接构建质粒pPIC9K-Col1a1，然后质粒pPIC9K-Col1a1酶切线性化后转入毕赤酵母菌SMD1168中得到转基因毕赤酵母基因工程菌，通过诱导表达出胞外分泌的人Ⅰ型胶原α1链蛋白，该蛋白与其他无机材料混合，可作为生物可降解材料，用于组织缺损和修复等[37]。四川大学和山西锦波生物医药股份有限公司共建“川大-锦波功能蛋白联合实验室”开发了Ⅲ型重组人源胶原蛋白的制备工艺，其制备方法主要通过选取人胶原基因COL3A1的关键片段区域483–512 aa进行重复拼接，并在大肠杆菌工程菌中诱导表达。所得的重组人源化Ⅲ型胶原蛋白水溶性强、生物活性高[38]。本课题组则选取COL3A1基因中富含活性位点的区段428–1 172 aa进行克隆，并在毕赤酵母中进行表达。此外，本课题组还完成了类胶原蛋白、Ⅰ型胶原蛋白、Ⅱ型胶原蛋白等一些重要的胶原蛋白原料的重组表达及产业化应用。

近年来，胶原蛋白已被广泛用于生物支架材料、化妆品、食品和医疗器械等领域，基于胶原蛋白的产品开发主要集中在骨修复、皮肤创面修复敷料、肌腱修复、药物输送和美容等方面。

胶原蛋白作为细胞外基质的重要组成之一，能诱导上皮细胞增殖、分化和迁移。与生物合成敷料相比，胶原复合敷料与成纤维细胞相互作用形成创面收缩力，减少创面的粘连和收缩强度[15]。Cao等[39]制备了一种类人胶原蛋白-羧甲基壳聚糖(human-like collagen-carboxymethylated chitosan, HRC-CCS)皮肤支架水凝胶，具有良好的促进创面皮肤组织再生能力。Pan等[40]合成了具有透气性、细菌阻隔性和止血活性的多功能PVA/HRC/SA复合水凝胶，能促进全皮层创面愈合。Lei等[41]以谷氨酰胺转氨酶作为交联剂形成透明质酸(hyaluronic acid, HA)、羧化壳聚糖和类人胶原蛋白的水凝胶混合敷料，可有效预防细菌感染，促进烧伤创面愈合。胶原蛋白具有良好的生物相容性、可降解性及诱导成骨分化的作用，被用于骨缺损修复。Hamzah等[42]使用胶原蛋白包埋聚乳酸制成了一种潜在的仿生聚合物3D骨支架，可作为骨组织工程应用材料。James等[43]将胶原蛋白与羟基磷灰石复合成一种羟基磷灰石矿化胶原复合物，可用作骨传导涂层和支架。在齿科修复治疗中，将胶原蛋白填补到牙周骨质缺损部位，可加速牙周骨质增生和牙龈再生[20]。

此外，鉴于生长因子在创面修复中具有重要的作用，本课题组[21]利用基因工程技术设计和构建了一种包含天然Ⅰ型胶原蛋白的细胞粘附结构域新型的重组类胶原蛋白(recombinant human-source collagen, RHC)，将RHC与表皮生长因子(epidermal growth factor, EGF)复合制成冻干敷料，不仅可以保持周围伤口湿润，还可以主动加速伤口愈合过程。由此可见，胶原蛋白广泛参与组织修复和创面愈合的过程，基于胶原蛋白的生物材料在组织修复和创面愈合中扮演着重要的角色。

胶原蛋白是皮肤的主要成分，随着年龄的增长，胶原蛋白流失，使得皮肤失去弹性和光泽，甚至会出现色斑等老化现象。因此，胶原蛋白被广泛开发成护肤产品配方。含胶原蛋白的护肤品与皮肤的亲和力强，具有保湿、柔软、抗氧化和紫外线防护等生物活性。在化妆品配方中常用的胶原蛋白为水解胶原蛋白及重组胶原蛋白，与天然胶原蛋白相比，水解胶原及重组胶原的分子量小，在中性条件下具有出色的溶解性、水结合和易渗入真皮的特性[44]。本课题组在前期研究中开发了一种重组类人胶原蛋白(recombinant human-like collagen, rhLEC)[45]及功能结构胶原蛋白(functional-construction collagen, FCC)[46]，在化妆品中添加时具有促进细胞粘附、组织胶原新生、修复受损皮肤的作用。在医学美容方面，胶原蛋白注射剂已广泛用于修复皮肤缺陷及皮下疾病。面部局部注射胶原蛋白可以达到面部轮廓矫正、皱纹、瘢痕修复等效果。目前，国内市场将天然胶原蛋白应用于化妆品及医学美容的企业主要有广州创尔生物、台湾双美、无锡贝迪生物、长春博泰、北京益尔康、上海昊海生科、北京克劳德、哈尔滨沛奇隆等；而重组人源胶原主要厂家为山西锦波生物医药股份有限公司、陕西巨子生物技术有限公司、广东丸美生物技术股份有限公司、广州市暨源生物科技有限公司、广州暨南大学生物医药技术研究开发中心有限公司、北京未名拾光生物技术有限公司、江苏创健医疗科技有限公司、山东华熙生物科技有限公司、江苏江山聚源生物技术有限公司等。其中生产重组人源胶原蛋白的初创企业不断增加，如未名拾光通过基因重组和生物发酵，利用“分子压缩”技术制备出更小的蛋白分子，从而达到普通胶原无法达到的，已建立了植物与人体的天然生物活性分子数据库，并基于此设计并交付了一款来源于胶原蛋白的具有抗衰功能的护肤原料(CN114842916A)[47]，并希望通过合成生物学技术为开发新的医美、护肤产品；江苏创健以开发重组胶原蛋白为使命，致力于重组胶原基生物材料的研发与生产，构建了人Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、ⅩⅦ型胶原蛋白的制备方法，提高了目的产物的产率(CN114106150B[48]、CN114774460A[49]、CN114480471A[50]、CN113185604B[51]、CN110747198B[52]、CN110606896B[53]、CN110964099A[54]和CN109988243A[55])；江苏江山聚源专注于仿生重组蛋白产业化设计与应用，从事重组人源胶原蛋白及下游产品的研发、生产，构建了重组人源Ⅰ、Ⅲ、ⅨⅢ型胶原蛋白、表达菌株及构建方法(CN111363029B[56]、CN113880940A[57]、CN113880941A[58])。

在食品工业中，食品包装材料需要排出氧气和控制水分迁移，在保持食品感官品质的同时，并防止脂肪氧化、变色和微生物侵入。胶原蛋白具有抗氧化活性，其水解物被用于抑制脂质过氧化，降低脂质过氧化对人体造成的影响，可用作薄膜和涂层等包装材料的开发。在保护、维持和延长食品保质期方面发挥了重要作用[59]。如明胶作为一种热变性胶原蛋白，被广泛用作食品添加剂、微胶囊化剂和可生物降解的包装材料。但其机械强度较差、吸湿性高，与高水分食品接触时易膨胀溶解，限制了其在食品包装中的直接应用。而通过化学或物理方法将明胶进行交联或与其他生物聚合物组合，可降低明胶链的流动性，提高其稳定性、耐水性、耐热性、阻隔性和机械性能。

胶原蛋白因低免疫原性、可生物降解性、修复特性及止血特性等成为了理想的生物医学材料，广泛应用于医用敷料、骨修复材料(人工骨)、手术缝合及药物载体等领域。胶原蛋白用于生物医学材料，无论组织类型如何，在选择用于组织工程的材料时，应考虑许多关键因素，如生物相容性、生物降解性、机械支撑性等(表 4)，而这些功能的实现将决定支架是否适合用作模拟细胞天然生理环境的生物材料[60]。胶原蛋白作为天然细胞外基质的主要结构成分，具有高生物相容性、生物降解性和延展性；但胶原蛋白通过自身形成的纤维状结构支架表现出较差的机械性能，因此需要对材料进行改性以达到最佳效果。目前，改性策略主要是将胶原蛋白与其他天然聚合物结合，如将胶原蛋白与具有高生物相容性、适度降解和抗菌作用等特性的壳聚糖结合，获得机械性能和生存能力更强的片状结构。与单一胶原蛋白材料相比，将胶原蛋白与天然聚合物共混可开发出一种具有改进的机械性能和生物相容性的新型材料。此外，胶原蛋白还能与不同的聚合物混合用于皮肤、骨骼及黏膜的修复[61] (表 5)。

除二元混合物之外，胶原蛋白与多种不同聚合物制成的混合物也是新趋势。这种材料通常基于细胞、生物活性分子和材料的整合，能充当细胞外基质为组织提供结构支撑、组织再生、允许营养物质和气体的扩散，为细胞增殖提供所需的微环境[60]。如胶原蛋白、透明质酸和壳聚糖三者复合可用于生产具有独特结构和机械特性的人造混合物(图 3)。本课题组前期根据颅骨创伤性缺陷模型设计了一种TGF-β3/重组类胶原蛋白RHC/壳聚糖冻干海绵混合材料[73]，可快速恢复颅骨创伤性缺损，其治疗效果优于单独使用胶原蛋白、壳聚糖或TGF-β3。因此，不同材料的复配及组合可达到性能互补的效应，而不同组分比例的调配可调控材料的性能，不仅能降低复合材料的生物降解作用，而且还能改变材料的力学性能、药物缓控释性能和抗菌性能等，这是未来胶原蛋白生物材料的重要发展方向之一。

在医疗器械中，胶原蛋白的主要用途包括创面愈合、皮肤修复、皮炎、湿疹、痔疮、口腔黏膜炎、口腔溃疡、疤痕及过敏性鼻炎等。随着胶原蛋白在医疗器械方面的广泛应用，2021年3月15日，国家药品监督管理局发布《重组胶原蛋白生物材料命名指导原则》[74]对重组人胶原蛋白、重组人源化胶原蛋白和重组类胶原蛋白做出明确定义，并要求企业在医疗器械领域重组胶原蛋白生物材料的命名中采用“核心词A+核心词B (表明产品形态)”的形式。2021年4月15日，国家药品监督管理局发布《重组胶原蛋白类医疗产品分类界定原则》[75]明确规定重组胶原蛋白类产品的管理类别不低于Ⅱ类医疗器械。胶原蛋白作为无源植入物，及产品可部分或全部被人吸收或用于体内的止血海绵或医用敷料时按Ⅲ类医疗器械管理。这标志着对于市场层面重组胶原蛋白的创新和应用，政策层面已显示出更为积极的响应和规范举措，表明相关部门规范行业发展的决心，另一方面也体现了政策对创新产业发展的敏感度和支持力度。目前，国内基于胶原蛋白开发的医疗器械按用途、适应症、产品名称、注册类别和生产厂家归类见表 6。

胶原蛋白来源丰富，可以从不同的物种(如牛、猪、家禽和海洋生物)中提取。其中，牛胶原蛋白成本低且提取方便，因此使用最多。虽然海洋胶原蛋白具有较高的吸收率和生物利用度，但由于提取和制造成本高昂，技术尚不完善，无法实现工业化生产，其使用相对有限。此外，利用重组技术生产胶原蛋白也取得了长足的进步，但是目前制备的重组胶原蛋白的产量、羟脯氨酸羟化率、三螺旋结构特性及纯度仍有待提升和改进。随着第三次生物技术革命的合成生物学技术的发展，以“基因调控，工程设计”为核心，从胶原蛋白分子的定向设计、细胞工厂构建与适配调控等方面出发，通过设计、构建和调试优化突破自然进化的限制，实现人工设计指导下胶原蛋白的定量可控表达、功能定向强化以及规模化生产值得期待。

与大多数仿生材料的低生物活性相比，胶原蛋白具有良好的生物降解性和生物相容性，以及足够的可塑性，被广泛应用于食品、医疗用品、3D打印、化妆品等多个行业，且全球胶原蛋白市场仍在持续增长。然而，胶原蛋白是亲水性的，机械强度差，需要进行改性程序以改善最终应用的物理化学性能。基于胶原蛋白的仿生材料可以通过多种材料进行改性，以提高其生物学性能和机械性能。目前基于胶原蛋白的仿生材料通常为柔性水凝胶和刚性支架。虽然，这些胶原复合材料已经在体外用于多种组织修复，但是仍然缺乏完整的体内实验来验证这些材料的实用性。此外，要制造能够满足所有所需性能(包括孔隙率、孔径、生物相容性、机械完整性、结构稳定性)的复合材料用于组织修复与再生仍然是一个挑战。但随着生物打印技术、组织工程和仿生技术的发展，复合胶原基材料在组织工程领域的应用有望取得突破。

此外，胶原蛋白作为皮肤中重要成分，凭借其良好的支撑、修复、保湿、美白等性能，在注射填充材料、功效性敷料、功效性护肤品及一般护肤品领域中扮演一个重要材料角色。其中，胶原蛋白有望凭借其支撑填充、修复、保湿及美白四重功效成为填充领域的重要材料之一。目前，各胶原蛋白企业纷纷完善下游胶原蛋白产品布局，扩充产品管线和拓展品类，使胶原蛋白逐步从医用场景走向多场景，实现“严肃医疗-消费医疗-日化”全覆盖。