SBB：土壤微生物群落的特征究竟由什么决定

Environmental conditions rather than microbial inoculum composition determine the bacterial composition, microbial biomass and enzymatic activity of reconstructed soil microbial communities

Impact Factor：5.290

https://doi.org/10.1016/j.soilbio.2015.07.018

发表日期：2015-08-04

第一作者：Weibing Xun(荀卫兵)a,b

通讯作者：Ruifu Zhang(张瑞福)([email protected])a,b

合作作者：Ting Huang,Jun Zhao,Wei Ran,Boren Wang,Qirong Shen

主要单位：

a南京农业大学国家有机类肥料工程技术研究中心(National Engineering Research Center for Organic-based Fertilizers, Jiangsu Key Lab and Engineering Center for Solid Organic Waste Utilization, Nanjing Agricultural University, Nanjing 210095, PR China)

b中国农业科学院农业资源与农业区划研究所农业部微生物资源收集与保藏重点实验室(Key Laboratory of Microbial Resources Collection and Preservation, Ministry of Agriculture, Institute of Agricultural Resources and Regional Planning,Chinese Academy of Agricultural Sciences, Beijing 100081, PR China)

分享标题：SBB：重建土壤微生物群落的特性究竟由谁决定

关键字：γ射线灭菌，土壤培养，细菌群落，微生物生物量，酶活性

点评：时势造英雄，还是英雄造时势，作者开启灵活大胆的思维方式运用巧妙的实验构思设计，通过一番“玩泥巴”的骚操作严密谨慎全面的论证了“时势造英雄”的观点，使我们更进一步了解了土壤细菌群落产生和维持的机制，表明了土壤的pH值是影响重建新细菌群落的主导因素，最终得出土壤微生物群落的组成和功能主要取决于土壤性质，而不是微生物接种物的观点，实验设计新颖巧妙，VPA分析等结果说服力强，最后提出一“橄榄球”模型“画龙点睛”之笔深入浅出地说明了问题。

土壤中微生物群落的组成和酶活性的水平都是土壤质量的重要指标，但土壤细菌群落产生和维持的机制尚不完全清楚。我们从同一地点采集了两份土壤样品，但每一份都经过了不同的长期施肥处理，其微生物多样性、生物量和理化性质各不相同。我们将这些样品进行γ灭菌并交换接种。将未灭菌的土壤样品以及经过灭菌和接种的土壤样品孵育八个月，然后分析其营养成分，微生物生物量，酶活性和细菌组成。未灭菌土壤中的总磷和钾浓度以及总有机物含量均与已灭菌并自我/交换接种的同一土壤中的总磷，钾浓度相同。此外，微生物生物量碳浓度不受特定接种物的影响，仅受土壤类型的影响。与用有机肥和化肥改良土壤（NPKM）接种微生物的无菌土壤以及未灭菌土壤样品进行比较，用化肥改良土(NPK)接种微生物的无菌土中过氧化氢酶、转化酶、脲酶、蛋白酶、酸性磷酸酶和植酸酶活性较低。454-焦磷酸测序法检测的细菌16S rRNA表明，尽管微生物接种物中细菌类群的丰度不同，土壤中的迁入微生物接种物重建的细菌群落组成主要由土壤理化性质的影响。例如，土壤的pH值是影响重建新细菌群落的主导因素。综上所述，这些结果表明，土壤微生物组成和功能主要取决于土壤性质，而不是微生物接种物，这有助于我们了解土壤微生物群落是如何产生和维持的。

土壤中的生物活性主要取决于微生物支持的生态系统过程，这对于维持养分循环的强度和稳定性尤其重要。因此，确定微生物群落在土壤中产生和维持的机制对于理解其生物功能至关重要。

一般来说，通过人工运输或自然传播到达新环境的生物需要应对两个主要压力:环境改变和与当地生物群落的新的互动。细菌利用一系列的策略来适应它们的新环境，包括形态可塑性的发展，利用精氨酸脱氨酶系统来应对酸性环境，以及与吞噬细胞的相互作用来应对氧化应激。

一个世纪以前，微生物生物地理学是这样描述的:万物皆在，环境选择；然而，最近的一些想法对这一观点提出了挑战。当生物体面临不利的环境条件时，它们就会休眠。这些不利的环境条件，包括偏离最佳pH值、土壤养分不良、高温或低温、有毒物质等，都是生物体生存的挑战。了解这些挑战对原位微生物群落重建具有重要意义。

休眠的微生物产生一种微生物接种体，这种接种体将导致未来群落的多样性和动态变化。以前的研究已经解决了具有相同原始微生物群落的微生物群落组成的原位变化，但是将一种全新的微生物菌剂引入一个新的环境，特别是灭菌的环境，还没有得到很好的研究。

Nannipieri等人认为，每一种土壤都有自己的生物空间，因此在平衡条件下保持特定的微生物生物量值。土壤类型可能是维持细菌群落组成的决定因素，Griffiths等人建立了沙质和粘土质土壤的交换微生物群落，并报道了微生物群落的组成取决于土壤类型，而不是接种源。Delmont等证实了这一点，他们确定了在两种不同的无菌土壤中发现的细菌群落组成，这些土壤已经接种了来自同一土壤的未灭菌样品或未灭菌的外来土壤样品。但是，这些实验本质上是使用了具有不同母体材料和不同植被的不同土壤。此外，在这些重建的微生物群落中新的微生物活性还没有被检测，而这些信息可能为了解微生物多样性和微生物功能之间的关系提供了思路。

我们假设，不仅土壤细菌组成，而且土壤微生物功能主要是由土壤性质决定的，而不是由微生物接种物决定的。为了对此进行测试，我们使用了过去23年中相同来源但施肥管理不同的两个土壤样品。交换接种它们的微生物群落，并通过16S rRNA基因的条形码焦磷酸测序来确定重建的细菌群落的组成。采用实时荧光定量PCR法检测功能基因丰度。我们也评估了土壤酶活性、理化性质和微生物生物量。

Soil sampling

土壤样品采集自中国农业科学院红壤实验站，位于中国南部的湖南省祁阳(111530E,26450N)，海拔120米。这个站的土壤被称为铁铝始成土，它最初是由第四纪红色黏土发展而来的。施肥试验始于1990年，包括冬小麦和夏玉米的年度轮作。在随机区组设计中采用两次重复进行不同的施肥处理。2011年11月从两个施肥处理中采集土壤样本，即化学施肥(氮肥、磷肥、钾肥、NPK)和粪肥化肥联合施肥(NPKM)。每个处理的新鲜样本取自两个重复的地块(每个地块8个随机土芯)，并充分混合以供进一步研究。这两种土壤样本被暂时保存在一个便携的储存箱里，被运送到实验室后都经过一个2毫米的筛子。用于测量酶活性和理化性质的样本被风干，用于DNA提取的样本被保存于—80℃冰箱，其余的样品暂存于4℃，以备进一步研究使用。

Microbial community swapping and incubating

将储存于4℃的土壤样品用γ射线(60 kGy)辐照灭菌后，将200克的无菌土壤放入500毫升的瓶中，室温静置8周。接下来，添加无菌水以保持恒定的水分含量（田间持水量的30％），样品在黑暗中20℃预培养2周后进行无菌检测。用已储存在4℃下的经NPK和NPKM处理的土壤样品制备微生物接种物，首先，土壤样本在20℃下置于定期充气的袋子中预培养两周。接下来，将20克土壤和20克玻璃珠(直径3-4毫米)放入180毫升无菌水中，摇匀20分钟。将20ml的土壤悬浮液与200g 经γ射线灭菌过的土壤混合，将经NPK处理土中的微生物接种到NPK组(自我接种对照，指定为NPKtoNPK)和NPKM组(指定为NPKtoNPKM)的灭菌土样品中。相反，将经NPKM处理土中的微生物接种到NPKM(自接种对照，指定为NPKMtoNPKM)和NPK(指定为NPKMtoNPK)两组的无菌土壤样品中。另外，将在4℃保存的200g未灭菌的NPK和NPKM土壤样品放入500 mL的无菌瓶中作为对照(分别命名为CKNPK和CKNPKM)。每个对照、自接种对照和交换接种处理各重复3次随机区组置于恒定湿度(田间容量的45％)、20 ℃条件下孵育8个月(2012.01-2012.08)。

Soil analysis

孵育八个月后，将土壤通过2毫米筛子，并进行了多次测量。采用PHS-3C mv/pH检测器(中国上海)测定土壤pH值，土壤水比为1:5，用碳酸氢钠提取有效P (AP) ，钼蓝法测定其浓度，用乙酸铵提取速效钾，火焰光度法测定速效K (AK)的浓度，总N (TN)测定采用凯氏消化法，用HFeHClO4提取总P(TP)和总K(TK)，分别用钼蓝比色法和火焰光度法测定其浓度，土壤有机质(SOM)浓度测定采用重铬酸钾容量法，微生物生物量碳(MBC)浓度测定采用氯仿熏蒸-萃取法。

测定了6种土壤酶活性：(i)过氧化氢酶，采用高锰酸钾法;(ii)脲酶，用苯酚次氯酸钠比色法测定产铵量;(iii)转化酶，采用3,5 -二硝基水杨酸比色法;(iv)蛋白酶，采用Gareth Jiang方法;(v)酸性磷酸酶，用磷酸苯二钠比色法;(vi)植酸酶，采用植酸钠分解和氯化亚锡比色法。

Bacterial community composition and functional genes abundances

使用PowerSoil DNA提取试剂盒(Mo Bio Laboratories Inc.， Carlsbad, CA, USA)从1.0 g的土壤中提取DNA。每个样本的连续三次DNA的提取被汇集，利用NanoDrop ND- 1000分光光度计(NanoDrop, ND2000, ThermoScientific, 111 Wilmington, DE)测定的260/280 nm和260/230 nm的吸光度比来评价DNA的质量。

利用ABI 7500实时PCR系统(美国Applied Biosystems公司)进行实时荧光定量PCR，以SYBR green为荧光染料，测定功能基因的相对丰度，如氨单加氧酶(amoA)、硝酸还原酶(narG)、亚硝酸盐还原酶(nirK和nirS)、一氧化二氮还原酶(nosZ)和固氮酶(nifH)基因。所有的PCR反应都是先在95℃条件下进行5分钟的酶激活，然后进行40个循环，95℃条件下15秒，60℃条件下34秒，最后升温至95℃条件下15秒。扩增产物的特异性也得到了验证。

基于细菌16S rRNA的V1-V3高变区，采用正如Dethlefsen等人和Huse等人之前描述的PCR引物F27: 5’-GCCTTGCCAGCCCGCTCAG-TC-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’ and R533: 5’-GCCTCCCTCGCGCCATCAG-AC-NNNNNNNNNN-TTACCGCGGCTGCTGGCAC-3’。每个融合引物包括Roche-454 A/B接头(以斜体显示)和一个2bp的linker sequence(以粗体显示)，然后是一个独特的纠错barcode sequence(Ns)和最后的16S rRNA引物。该引物扩增的区域非常适合用于细菌序列的精确系统发育分析。

随后，通过测序对每个土壤样本中的细菌群落进行了表征(454 GS-FLX Titanium System (Roche, Switzerland) by Majorbio Bio-pharm Technology Co., Ltd (中国，上海))。焦磷酸测序数据遵循Schloss标准操作程序(SOP)使用Mothur处理(版本1.27.1)。

基于Mothur的PyroNoise算法的重新执行使用默认参数对包含最小流长360和最大流长450的那些序列进行降噪。降噪这些序列包括(i)与正向引物序列有两个以上不匹配或/和条形码序列有一个不匹配的序列，(ii)包含非指定标签的序列;（iii）包含任何模棱两可base calls(Ns)的序列，(iv)包含同聚物超过八个核苷酸的序列，或者(v)小于200个碱基的序列。

用独特的10-bp条形码对原始序列进行分类和区分。对条形码和引物序列进行裁剪，然后根据Silva数据库对所有唯一序列进行比对。通过筛选、过滤、预聚类、去除嵌合体和去除singleton序列，将定义为可用读长的保留序列构建距离矩阵，距离阈值为0.2。使用平均邻域算法，以97%的相似度为界，将所有序列聚类到可操作分类单元(OTUs)中。选择每个OTU中最丰富的序列作为代表序列，剩余的序列根据其OTU被分类到每个样本中。然后用RDP朴素贝叶斯rRNA分类器对代表性序列进行分类，置信限为0.6。如果一个OTU(具有一个以上的读长)只出现在一个样本中，并且在少于两个重复中被检测到，则将其移除。

Statistical analyses

对于焦磷酸测序数据，每个分类的百分比被指定为相对丰度。采用去趋势对应分析(DCA)确定细菌群落的转化和整体功能变化，然后进行冗余分析（RDA），以确定影响其组成和结构的最重要的土壤变量。对于RDA，使用Mantel检验来检查群落结构与每个变量之间的相关性。只有通过Mantel检验确定为显著的变量(P < 0.05)被进行进一步的分析。MRPP用于比较有关环境变量的差异造成的群落并采用adonis检验不同因素对群落组成的影响。所有统计分析均采用R软件(version 3.0.1)中的Vegan包(v.2.0-8)。

Varying long-term fertilization had a significant effect on soil properties

尽管来自同一土壤，经过23年的不同施肥，我们在这项研究中收集的两个土壤样品具有明显不同的特征。NPKM土壤样品的pH和养分含量显著高于NPK (P < 0.001)。这表明，这两种土壤目前的细菌组成也有所不同，尽管这些细菌很可能在许多年前来自于同一个群落。

Swapping microbial inocula did not change the soil properties

在八个月的培育期后，各土样的理化性质(P < 0.001)(Table 1)和酶活性(P < 0.001)(Table 2)均存在显著差异。与CKNPK相比，NPKtoNPK或NPKMtoNPK样品的总磷(TP)、总钾(TK)、有机质(SOM)和微生物生物量碳(MBC)浓度变化不明显，土壤pH、有效氮(AN)、有效磷(AP)和有效钾(AK)存在显著差异(Table 1)。NPKM土壤样品表现出类似的方式情况。

Soil physicochemical characteristics and microbial biomass carbon concentrations of the controls, self inoculation and swap inoculation treatments

AN, 土壤速效氮；TN, 土壤总氮；AP, 土壤有效磷；TP, 土壤全磷；AK, 土壤有效钾；TK，土壤全钾;SOM, 土壤有机质;MBC，微生物生物量碳。

a NPK土壤， 未灭菌NPK土壤(CKNPK)和接种悬浮液的灭菌NPK土壤(NPKtoNPK, 来自NPK处理的土悬液接种的灭菌NPK土;NPKMtoNPK,来自NPKM处理的土悬液接种的灭菌NPK土)；NPKM土壤，未灭菌的NPKM土壤(CKNPKM)和接种悬液的灭菌NPKM土壤(NPKMtoNPKM, 来自NPKM处理的土悬液接种的灭菌NPKM土；NPKtoNPKM, 来自NPK处理的土悬浮液接种的灭菌NPKM土)。

b 数值显示NPK土与NPKM土有显著性差异(P < 0.001)。

c 数值(平均值±标准差)表示各个土壤特性的绝对数量。根据 Duncan’s多重比较，栏中不同的字母(以粗体显示)表示相同土壤中的不同处理之间存在显着差异(P