双向电泳操作步骤及相关试剂配制

A． 实验过程一、实验原理：2-DE 的第一向电泳等电聚焦是基于等电点不同而将蛋白粗步分离，第二向 SDS-PAGE 是基 于蛋白质分子量不同，而将一向分离后的蛋白进一步分离。这样就可以得到蛋白质等电点和 分子量的信息。二、实验步骤：1.样品的溶解取纯化后的晶体蛋白 3.0mg，加入 300μl 裂解液(1mg 蛋白:100μl 裂解液)振荡器上振荡 10min 左右，共处理一个小时。其中每隔 10～15 分钟振荡一次，然后 13200rpm离心 15min 除杂质，取上清分装，每管 70μl，—80℃保存。2.Bradford 法测蛋白含量

取 0.001g BSA（牛血清白蛋白）用 1ml 超纯水溶解,测定 BSA 标准曲线及样品蛋白含量。 取 7 个 10ml 的离心管，首先在 5 个离心管中按次序加入 0μl,5μl,10μl,15μl,20μl 的 BSA 溶解液，另 2 管中分别加入 2μl 的待测样品溶液，再在每管中加入相应体积的双蒸水（总 体积为 80μl），然后，各管中分别加入 4ml 的 Bradford 液（原来配好的 Bradford 液使用 前需再取需要的剂量过滤一遍方能使用），摇匀，2min 在 595nm 下，按由低到高的浓度顺 序测定各浓度 BSA 的 OD 值，再测样品 OD 值。(测量过程要在一个小时内完成)。例如：

Bt4 2 78 4 0.079

Bt4 4 76 4

转 Bt4 2 78 4 0.075

转 Bt4 4 76 4

标准曲线方程式：Y= aX+b.其中 Y 为 OD 值，X 为蛋白含量。a、b 通过作图输入数据可 知

相关系数通过输入数据，作图，软件分析可得

OD 值测量过程：

比色皿用 70%的乙醇保存，待用时用双蒸水冲洗，再用无水乙醇冲洗，双蒸水冲洗，再加 入待测样品溶液润洗，然后，加入样品，测定 OD 值。

3.双向电泳第一向---IEF（双向电泳中一律使用超纯水）

3.1 水化液的制备

称取 2.0mg 的 DTT，用 700μl 水化液储液溶解后,加入 8μl 0.05% 的溴酚兰，3.5μl（0.5%v/v）IPG buffer (pH 3-10)振荡混匀，13200rpm 离心 15min 除杂质，取上清。 在含 300μg 蛋白（经验值）的样品溶解液中加入水化液，至终体积为 340μl，振荡器上振 荡混合,13200rpm 离心 15min 除杂质，取上清。

3.2 点样，上胶

分两次吸取样品，每次 170μl,按从正极到负极的顺序加入点样槽两侧，再用镊子拨开Immobiline DryStrip gels (18cm，pH 3—10)胶条，从正极到负极将胶条压入槽中,胶面接触加入的样品。注意：胶条使用前，要在室温中平衡 30 分钟；加样时，正极要多加样，以防气泡的产生；压胶时不能产生气泡；酸性端对应正极，碱性端对应负极；样品加好后， 加同样多的覆盖油(Bio-Rad)，两个上样槽必须与底线齐平。

3.3 IPG 聚焦系统跑胶程序的设定（跑胶温度为 20℃） S1 (30v,12hr,360vhs,step)

S2 (500v,1hr,500vhs,step) S3 (1000v,1hr,1000vhs,step)

S4 (8000v,0.5hr,2250vhs,Grad)

S5 (8000v,5hr,40000vhs,step)共计 44110vhs,19.5 小时

其中 S1 用于泡胀水化胶条，S2 和 S3 用于去小离子，S4 和 S5 用于聚焦。

3.4 平衡 用镊子夹出胶条,超纯水冲洗后，在滤纸上吸干（胶面，即接触样品那一面不能接触滤纸， 如果为 18cm 的胶条要将两头剪去），再以超纯水冲洗，滤纸吸干（再次冲洗过程也可省略）， 然后用镊子夹住胶条以正极端（即酸性端）向下，负极端（即碱性端）向上，放入用来平衡 的试管中（镊子所夹的是碱性端，酸性端留有溴酚兰作为标记），用平衡液 A，平衡液 B 先 后平衡 15min。注:平衡时要注意保持胶面始终向上,不能接触平衡管壁。 平衡第二次时，在沸水中煮 Marker 3min,剪两个同样大小的小纸片，长度与一向胶条的宽 度等同，然后吸取煮好的 Marker，转入 SDS—PAGE 胶面上，保持紧密贴合；同样在第二 次平衡时，煮 5%的琼脂糖 10ml。

4.双向电泳第二向---SDS-PAGE

4.1 配胶(两根胶条所用剂量)

分离胶：（T=8% 80 ml）：溶液于真空机中抽气后再加 APS 和 TEMED

30 % 丙烯酰胺储液 21.28ml

分离胶 buffer 20ml 10%APS 220μl TEMED 44μl

双蒸水 38.72ml 浓缩胶：（T=4.8% 10ml） 30 % 丙烯酰胺储液 1.6ml

浓缩胶 buffer 2.5ml 10%APS 30μl TEMED 5μl

双蒸水 5.9ml

4.2 灌胶 将玻璃板洗净后,室温晾干,然后,将电泳槽平衡好,玻璃板夹好,再在玻璃板底部涂上凡士林以 防漏胶,倒入正丁醇压胶,凝胶后(这时会出现三条线),用注射器吸去正丁醇,超纯水洗两次,再 用滤纸除水后,倒入浓缩胶,正丁醇压胶,凝胶后,用注射器吸去正丁醇,超纯水洗两次,再加入超 纯水,用保险膜封好。

4.3 转移

剪两个小的滤纸片，吸取 Marker 后，放入 SDS—PAGE 胶面的一端。然后，将平衡好的 IPG 胶条贴靠在玻璃板上,加少量的 5%的琼脂糖溶液在胶面上(琼脂糖凝胶在转移前十几分钟的 时候配好,水浴加热溶解,并保持烧杯中水处于沸腾状态,至用之前再拿出来),再将 IPG 胶条缓 缓加入 SDS—PAGE 胶面,其中不断补加 5%的琼脂糖溶液,注意不能产生气泡。

4.4 跑胶

浓缩胶 13mA 分离胶 20mA 共约 5.5 个小时

5.银染(两根胶条所用剂量)（银染特别注意用超纯水）

5.1 固定 30min 无水乙醇 200ml+乙酸 50ml，用超纯水定容至 500ml

5.2 敏化 30min 无水乙醇 150ml

Na2S2O3S226;5H2O 1.5688g

无水乙酸钠 34g

先用水溶解 Na2S2O3S226;5H2O 和乙酸钠,再加乙醇,最后定容至 500ml

5.3 洗涤 5min × 3 次

5.4 银染 20min AgNO3 1.25g 用超纯水定容至 500ml

5.5 洗涤 1min × 2 次

5.6 显影 无水 Na2CO3 12.5g 用超纯水定容至 500ml

甲醛(37%)0.1ml,临时加

5.7 终止 10min EDTA—Na2S226;2H2O 7.3g 用超纯水定容至 500ml

5.8 洗涤 5min × 3 次 注：整个双向电泳实验中全部使用超纯水，尽量减少离子的影响。

B． 实验相关试剂配制

1． Bradford 工作液

95%乙醇 25ml 先用乙醇溶解考马斯亮兰 G250，溶解完后再加磷

85%磷酸 52ml 酸，最后超纯水定容至 500ml。过滤后置于棕色瓶 考马斯亮兰 G250 0.035g 外加油皮纸保存（Bradford 不稳定，一周内有效）

2． 裂解液 尿素 8M 硫脲 2M CHAPS 4%

DTT 60 mM

Tris—base 40 mM（如果有条件可以添加 PMSF 0.5mM 和 5%的 Pharmalate）

3.水化液储液 尿素 8M 硫脲 2M CHAPS 4%

Tris—base 40 mM

4.分离胶 buffer (pH8.8) 250ml SDS 0.4% 1g

Tris—HCl 1.5M 45.4275g

5.浓缩胶 buffer (pH6.8) 100ml

SDS 0.4% 0.4g

Tris—HCl 0.5M 6.07g

6.凝胶储存液（30%的丙烯酰胺）250ml Acr 29.2% 73g

Bis 0.8% 2g

7.电极缓冲液（跑一次要配制 2500ml） 甘氨酸 43.2g 36g

Tris 9g 或 7.5g SDS 3g 2.5g

超纯水定容至 3000ml 超纯水定容至 2500ml 8． 0.5M Tris —HCl pH 6.8 储液

6.1g Tris 先用 30ml 超纯水溶解，再用 46ml，3M HCl 调 pH6.8,再加水定容至 100ml

平衡液储液

脲（即尿素）36g

甘油 30% 30ml

SDS 1% 1g

0.5M Tris—HCl pH6.8 10ml 超纯水定容至 100ml

10.平衡液 A（一根胶条） DTT 20mg

平衡液储液 10ml 11．平衡液 B（一根胶条）

碘乙酰氨 300mg

平衡液储液 10ml

0.05%溴酚兰 15μl (平衡液 A、B 均需临时配制)

12．0.5%琼脂糖 10ml 琼脂糖 0.05g

电极缓冲液 10ml

溴酚兰 25μl

补：4、5、6 的溶液需过滤后储存于 4C 备用。

C． 药品

CHAPS 兼性离子去垢剂 去垢剂可破坏蛋白质分子之间的疏水相互作用，

SDS 离子型去垢剂 提高蛋白质的溶解性，防止在等电聚焦时析出 尿素 离液剂 可改变或破坏氢键等次级键的结构，使蛋白质硫脲 离液剂 变性并使蛋白失活。尿素和硫脲联合使用，可以大大增加蛋白质的溶解性

DTT 还原剂 断裂蛋白质分子中 Cys 残基之间形成的二硫键，增加蛋白质的溶解性。但过分 提高 DTT 的浓度，由于它 pKa 在 8 左右，因而会影响 pH 梯度。DTT 在碱性 pH 下会去质 子化，等电聚焦时会损耗，导致二硫键复原，蛋白质沉淀

BSA Bradford 中制作标准曲线用

无水乙醇 和磷酸一起，提供 Bradford 中的环境

磷酸 提供 Bradford 中的酸性环境

Tris 构成缓冲液的成分，可用于抗衡 pH 的变化

IPG buffer

覆盖液 即矿物油，防止水分蒸发，样品干燥。

丙烯酰胺（Acr） 以丙烯酰胺为单体，甲叉二丙烯酰胺为交联剂，

甲叉二丙烯酰胺 （Bis）在催化剂（Aps）和引发剂（TEMED）作用下，聚合交联成三维 网状结构

琼脂糖

溴酚兰 指示剂作用

碘乙酰氨（IAA）平衡液 B 中使用，中和 A 液中的 DTT 正丁醇 比聚丙烯酰胺密度小，用于凝胶制作过程中的压胶 甘油 无机盐的良好溶剂，热稳定性好

Marker

考马斯亮兰 G250（Bradford 法用）考马斯亮兰 G250 有红、蓝两种不同颜色的形式在一 定浓度的乙醇及酸性条件下，可配成淡红色的溶液，当与蛋白结合后，产生蓝色化合物，反 应迅速而稳定，反应化合物在 465~595nm 处有最大的光吸收值，化合物颜色 深浅与蛋白 浓度的高低成正比关系，因此可检测 595nm 的光吸收值的大小计算蛋白的含量

甘氨酸 与 Tris 构成缓冲系统

AgNO3

EDTA 金属螯合剂，可以结合银离子，终止银染过程。

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