生物基础实验之Western blot实验技术及原理

Western blot

原理：SDS使蛋白质带上负电荷，蛋白质从负极向正极移动。利用SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）分离样本中的各种蛋白质，并将分离的蛋白质转移到PVDF膜上，将膜与对应的特异一抗一起孵育。洗膜过程中，未结合抗体的抗体被洗掉，只留下与目的蛋白结合的抗体。然后，孵育二抗，通过显影胶片或荧光扫描检测目的蛋白。条带的粗细对应目的蛋白在给定细胞或者组织匀浆中的表达情况。

步骤：

1.1 裂解细胞

(1) 开启制冰机，制冰。

(1) 悬浮细胞：收集细胞到10ml离心管，离心弃上清，PBS洗3遍（去掉培养基中的血清），将细胞转移到1.5ml EP管，加入适量裂解液，置于冰上30min，每隔5min摇匀，避免细胞沉到底部造成裂解不充分。贴壁细胞：去掉多孔板中的培养基，PBS洗3遍（去掉培养基中的血清），每个孔板加入适量的裂解液并迅速用细胞刮刮下细胞并转移至1.5mlEP管，置于冰上30min，每隔5min摇匀，避免细胞沉到底部造成裂解不充分。裂解液配方：100μL裂解液+1μL蛋白酶抑制剂+1μLPMSF

(2) 13000rpm, 4℃离心20min，收集上清转移至另一1.5mL EP管。

1.2 蛋白定量

(1) 制备并绘制蛋白浓度和吸光值相关的标准曲线。

(2) 稀释10倍蛋白样本：2μL蛋白样本+18μLPBS。加入AB混合液，37℃孵育30min。

(3) 计算样本总蛋白浓度。每孔上样量为20μg，质量除以浓度得到上样体积。

(4) 煮蛋白：5X loading buffer体积 : 蛋白样本体积为1:4。混匀，缠紧封口膜避免造成蒸发而改变蛋白浓度，100℃，煮沸10min。掌上离心机将水蒸气离下并混匀。负二十或负八十摄氏度保存。（loading buffer 中含有SDS使蛋白质带上负电荷）

1.3 电泳-转膜-显影

5X 电泳液：称量下列试剂，置于1L烧杯中，加入800mL dd H2O，搅拌溶解。加dd H2O定容置1L, 室温保存。

Glycine 94g

Tris 15.1g

SDS 5g

1X电泳液：200mL 5X电泳液+800 mL dd H2O.

5X 转膜液：称量下列试剂，置于1L烧杯中，加入800mL去离子水，搅拌溶解。加去离子水定容置1L, 室温保存。

Glycine 72g

Tris 15g

1X转膜液：200mL 5X转膜液+800 mL dd H2O。

1M Tris-HCL:

Tris 12.11g

dd H2O 70mL

浓盐酸 调至PH=7.5

dd H2O定容至100mL。

5X TBS: 称量下列试剂，置于1L烧杯中，加入800mL去离子水，搅拌溶解。加去离子水定容置1L, 室温保存。

NaCl 44g

1M Tris-HCL (PH=7.5) 50mL

dd H2O定容至1L。

1X TBST:

5X TBS 200mL

Tween-20 1mL

dd H2O 799mL

(1) 根据分子量大小选择配置合适浓度的分离胶，缓慢加水或者乙醇将分离胶压平。分离胶凝固后，将水倒出。配置浓缩胶，倾斜插入梳子以将气泡赶出。配胶动作轻缓，避免产生过多起泡。

(2) 第一孔和最后一孔加4或者5μLmarker，上样20μg/孔，注意上样顺序。

(3) 电泳：浓缩胶80V, 20-30min左右，分离胶120V, 40-50min左右。

(4) 根据分子量大小裁剪合适大小的PVDF膜，并泡入无水甲醇激活并用TBST稍微漂洗，除去膜上多余甲醇（膜被浸湿1-2min即可）。（甲醇能破坏 SDS 与蛋白的结合，促使蛋白与膜结合。但是能破坏 PAGE 胶，使一些蛋白发生沉淀，从而影响到实验结果。）

(5) 切胶，将第一孔marker置于右边，并且将膜的右上角剪去一小角，便于区分左右。赶走膜与胶之间的气泡。转膜采用三明治法：黑色板（负极）-泡沫-厚滤纸-薄滤纸-胶-膜-薄滤纸-厚滤纸-泡沫-红色板（正极）。凝胶靠近负极,膜靠近正极。（SDS 跟蛋白质结合后使蛋白质带上负电荷，所以蛋白质从负极跑向正极。）转膜过程中需加冰块降温。

(6) 封闭：5%脱脂奶粉（5g脱脂奶粉+100mLTBST），常温孵育大于等于30min。

(7) 4℃一抗孵育过夜，用TBST洗一抗，5遍，6min/遍。常温或者37℃孵育二抗1h，5遍，6min/遍。

(8) 配置显影液。开机预冷发光成像系统，相机温度将为负30℃后，膜放正，于膜正上方滴加显影液，显影出目的条带。

1.4数据分析

利用Image J软件，扫描条带灰度值。目的带白灰度值/内参带白灰度值得到的数据为目的带白的相对表达量。三次独立实验计算P值大小并做统计分析。